興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的克隆及特性分析.pdf

1、興安落葉松（Larix gmelinii）主要分布于我國東北地區(qū)，是森林生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢樹種，既能在高寒環(huán)境下生存，又能在復(fù)雜的逆境條件下正常生長，是研究植物抗逆基因的良好材料。幾丁質(zhì)酶是一種植物抗逆相關(guān)蛋白，特別是在植物抵御病害及低溫的過程中發(fā)揮重要的作用，它具有熱滯活性，能夠降低冰點(diǎn)、抑制冰晶生長及重結(jié)晶，從而保護(hù)植物免受凍害。
　　本研究以分析幾丁質(zhì)酶在興安落葉松抵御低溫中所發(fā)揮的作用，探討其在提高轉(zhuǎn)基因植物抗寒性中的可應(yīng)用

2、性為目的，通過RT-PCR技術(shù)克隆得到了一個興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因，命名為LgChi2。LgChi2 cDNA全長包含一個831bp的開放閱讀框，編碼276個氨基酸，蛋白分子量為28.4kDa，理論等電點(diǎn)為7.83，DNA全長為1395bp，包含兩個內(nèi)含子，三個外顯子。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，LgChi2與挪威云杉、花旗松、日本柳杉等植物的classⅣ幾丁酶基因具有極高的同源性。利用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞對LgChi蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析

3、的結(jié)果顯示，LgChi∷GFP融合蛋白定位于細(xì)胞邊緣。表達(dá)特性分析結(jié)果顯示，該基因主要表達(dá)在興安落葉松的幼莖中，在4℃低溫脅迫條件下，LgChi2的表達(dá)量明顯增加，顯示該基因?yàn)檎T導(dǎo)型表達(dá)基因。同時，低溫脅迫條件下興安落葉松幾丁質(zhì)酶的活性呈先升高后下降的趨勢，進(jìn)一步顯示幾丁質(zhì)酶基因在興安落葉松抵御低溫脅迫中發(fā)揮作用。
　　為進(jìn)一步分析該基因在植物適應(yīng)低溫脅迫中的應(yīng)答機(jī)制，我們分別構(gòu)建了真核的雙元表達(dá)載體pBI101-LgChi和原核

4、表達(dá)載體pET32a(+)-LgChi，并通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法深入分析其在提高轉(zhuǎn)基因生物抗寒性中的作用。結(jié)果表明，pET32a(+)-LgChi重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，觀察到與預(yù)期大小一致的融合表達(dá)蛋白，同時，LgChi基因在大腸桿菌DE3中超表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞在低溫脅迫下的生長速度。低溫脅迫下，轉(zhuǎn)LgChi基因擬南芥和野生型擬南芥的三種抗氧化物酶即過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)的活性均增