利用小麥SSR研究其近緣物種的遺傳多樣性及其微衛(wèi)星序列的進(jìn)化.pdf

1、微衛(wèi)星序列作為研究物種進(jìn)化的重要工具已經(jīng)越來(lái)越被人們重視，許多串聯(lián)重復(fù)序列在基因組中具有重要的功能。目前，普遍認(rèn)為具有3個(gè)作用：一是組成開(kāi)放閱讀框的一部分；二是參與基因組的調(diào)節(jié)活動(dòng)，(GA)n/(CT)n位于基因的啟動(dòng)子區(qū)域，是基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制中的一個(gè)重要組成部分；三是組成染色體的脆性位點(diǎn)?；蚪M是一個(gè)復(fù)雜的信息儲(chǔ)存系統(tǒng)在基因組系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中，重復(fù)序列作為主要的決定因素影響著DNA復(fù)制、染色體分離、基因表達(dá)等重要生命活動(dòng)。大量的研究結(jié)果表明

2、：微衛(wèi)星DNA(SSR)在物種多態(tài)性檢測(cè)方面具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建、主要性狀基因的定位、遺傳圖譜及系譜分析，以及分子標(biāo)記輔助選擇育種等多個(gè)方面。 盡管SSR的應(yīng)用前景非常廣闊，但從基因組文庫(kù)中開(kāi)發(fā)某一物種SSR標(biāo)記是非常昂貴和費(fèi)時(shí)的，因?yàn)樗髲囊阎男蛄兄虚_(kāi)發(fā)合適的多態(tài)性信息位點(diǎn)，這一點(diǎn)不同于其它分子標(biāo)記。上個(gè)世紀(jì)90年代人們就提出某一物種的開(kāi)發(fā)出來(lái)的微衛(wèi)星引物能否

3、在其他相近物種中轉(zhuǎn)移使用，研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA的側(cè)翼序列比較保守，某一物種的微衛(wèi)星引物可在相近物種中使用，這可以減少獲取微衛(wèi)星的工作量.在小麥族中前人成功的將小麥微衛(wèi)星引物應(yīng)用于黑麥、簇毛麥、山羊草等物種的研究中。這種簡(jiǎn)單有效的方法增加了相關(guān)物種的微衛(wèi)星引物數(shù)量，通過(guò)這種方法還可以獲得更多的種屬特異分子標(biāo)記。這樣便可以為近緣物種的研究節(jié)約大量的成本。有利于探明近緣物種間的遺傳同源性以及物種起源等生命科學(xué)領(lǐng)域中的重要問(wèn)題。 本文利

4、用小麥微衛(wèi)星引物，對(duì)小麥近緣屬中遺傳多樣性和特異分子標(biāo)記，以及近緣屬中的微衛(wèi)星序列的變異與進(jìn)化進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下： 1.利用小麥微衛(wèi)星DNA分析小麥近緣物種植物的遺傳多樣性利用218對(duì)小麥SSR引物對(duì)小麥及其近緣種共22個(gè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從中篩選到39對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，這些引物可在供試材料中檢測(cè)出213個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)位點(diǎn)可檢測(cè)到5.4個(gè)等位基因。位點(diǎn)多態(tài)性信息量(PIC)變幅為0.38～0.89

5、，平均為0.57。NTSYS軟件的分析結(jié)果表明22份材料的遺傳相似系數(shù)范圍為0.46～0.94，平均遺傳相似系數(shù)為0.67，聚類(lèi)分析結(jié)果顯示小麥、偃麥草、大賴(lài)草、黑麥均各自聚類(lèi)，與傳統(tǒng)的物種分類(lèi)結(jié)果有較高的吻合度。這表明(1)SSR可以應(yīng)用于小麥與其近緣種的遺傳多樣性研究。(2)SSR揭示的小麥與其近緣物種間的多態(tài)性高，可以用來(lái)鑒定小麥近緣種。 2.發(fā)掘新的小麥與小麥近緣物種的特異分子標(biāo)記本實(shí)驗(yàn)選位于普通小麥1A-7A、1B-7

6、B、1D-7D染色體上的126對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)普通小麥中國(guó)春、MY11、簇毛麥、粗山羊草、大賴(lài)草、偃麥草、黑麥七個(gè)材料進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12個(gè)引物可以在黑麥中擴(kuò)增出特異帶來(lái)，8個(gè)引物可以在簇毛麥中擴(kuò)增出特異帶來(lái)，山羊草有4個(gè)，大賴(lài)草有9個(gè)，偃麥草有10個(gè)，其中大多數(shù)片段大小在500bp左右。本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)黑麥的兩個(gè)特異性標(biāo)記進(jìn)行了分離和鑒定，(1)發(fā)現(xiàn)引物對(duì)Xgwm260在黑麥中擴(kuò)增出了一條長(zhǎng)大約1000bp的黑麥特異片段，而供試

7、品種小麥及其近緣屬物種均未擴(kuò)增出該片段，進(jìn)而用該引物對(duì)小麥黑麥雜交F1代以及小麥-黑麥雙二倍體進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示所有含黑麥染色質(zhì)的材料都能擴(kuò)增出目標(biāo)片段。為了確定該特異性標(biāo)記在黑麥染色體組上的分布，我們利用引物Xgwm260對(duì)一套中國(guó)春-帝國(guó)黑麥二體附加系(1R17R)進(jìn)行擴(kuò)增，在1R-7R附加系中，僅有4R染色體能出該片段，這表明該標(biāo)記為黑麥4R染色體特有，可以應(yīng)用于小麥背景中黑麥4R染色質(zhì)的鑒定。對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收、克隆后進(jìn)行序列測(cè)

8、定，得到該片段的全長(zhǎng)序列為988bp，命名為PMD260-1000。序列分析結(jié)果表明序列中941位CACTA轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合，378-383有GC框，并且GC框上有SP1，序列倒位重復(fù)，并含有開(kāi)放閱讀框，推斷該序列結(jié)構(gòu)可能為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。(2)引物Xgwm232在黑麥中擴(kuò)增出一條491bp的特異帶，用上述同樣的方法證明其特異性，并且將其定位在6R染色上，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列含有兩個(gè)TATAA框。同時(shí)，將上述兩個(gè)序列在NCBI比對(duì)都

9、沒(méi)有同源性高的序列，說(shuō)明這兩個(gè)序列為新的特異片段。 3.通過(guò)分析序列研究小麥微衛(wèi)星序列的變異與進(jìn)化本實(shí)驗(yàn)在小麥近緣物種中克隆測(cè)定了一些特異重復(fù)序列，將測(cè)序結(jié)果輸入NCBI的GENEBANK里進(jìn)行同源性比對(duì)，并用DNAMAN軟件分析序列結(jié)構(gòu)，用來(lái)研究這些片段在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的變異。發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列中含有多個(gè)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的保守序列以及與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相似的核苷酸序列。盡管已有小麥或黑麥特異的重復(fù)序列被分離出來(lái)，但仍有大量重

10、復(fù)序列等待發(fā)掘。 4.發(fā)掘新的特異重復(fù)序列，闡明特異重復(fù)序列在小麥族植物中的分布與進(jìn)化規(guī)律。(1)序列PMD-268與四倍體栽培小麥TriticumturgidumL.Langdon一致性達(dá)到97％.在進(jìn)化過(guò)程中該序列的TATA框發(fā)生了突變，與這部分基因組序列的差異主要存在于重復(fù)序列的側(cè)翼序列，這就使引物結(jié)合區(qū)發(fā)生了變異，導(dǎo)致在所有供試四倍體小麥中未能擴(kuò)出。另外發(fā)現(xiàn)該序列與雙倍體小麥(Triticummonococcum)act

11、ingene(AF326781.1)與六倍體栽培小麥TriticumaestivumcultivarRenancloneBAC930H14中部分核苷酸序列的一致性達(dá)到100％，35-66位核苷酸序列含有TATA框并且與一致序列TATAWAW(氨基酸序列)相對(duì)應(yīng)，該序列可能與轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)。(2)PMD120-500序列為倒位重復(fù)，序列上下有各含有一個(gè)TATAA框，1是啟動(dòng)子的特征性序列。3’側(cè)翼區(qū)序列含有一個(gè)特征性的加尾信號(hào)序列AATA

12、AA，符合終止子的序列特征。該序列與小麥醇溶蛋白基因G2656gamma-gliadingene中的核苷酸序列位5941-6306有高達(dá)91％的同源性，其中有兩個(gè)AATAAA框發(fā)生了突變，進(jìn)化過(guò)程中終止子突變可是由于堿基的突變、插人或缺失，有可能對(duì)調(diào)控元件之間的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。與大麥屬Hordeumvulgaresubsp.vulgareeIF4Egenelocus轉(zhuǎn)錄起始因子核苷酸序列的112712-113159位有高達(dá)91％的同源