棉花抗黃萎病新種質(zhì)創(chuàng)制及黃萎病菌脅迫后D基因組熱激蛋白70基因家族的表達(dá)分析.pdf

1、棉花屬于全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物，是紡織工業(yè)原料、食用油和飼料蛋白的重要來源。棉花生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常遭受逆境脅迫的影響，引起產(chǎn)量、纖維品質(zhì)和植棉效益的多重?fù)p失，因此提高棉花抗生物逆境、非生物逆境脅迫的能力顯得尤其重要。棉花生育期內(nèi)會(huì)受到枯萎病、黃萎病、棉鈴蟲、棉蚜和盲蝽蟓等生物逆境的脅迫，通過遺傳改良，目前推廣品種已經(jīng)具備對(duì)枯萎病、棉鈴蟲和棉蚜的抗性，而黃萎病的防治至今仍然是一項(xiàng)技術(shù)難題，由于頻繁發(fā)生引起嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，在棉花生產(chǎn)上被稱為“

2、癌癥”。棉花黃萎病為真菌性的維管束病害，通過種子、土壤、病株殘?bào)w和棉籽殼以及棉籽餅傳播。棉花抗黃萎病育種進(jìn)展緩慢的原因在于病原菌生理小種的變異和主栽棉種陸地棉中嚴(yán)重缺乏高抗水平的抗源。本研究采用植物基因工程手段和棉花遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將天麻抗真菌蛋白基因和棉屬野生種抗黃萎病性狀轉(zhuǎn)育到陸地棉遺傳背景中，開展棉花抗黃萎病新種質(zhì)的創(chuàng)制，并利用已獲得的高抗黃萎病種質(zhì)系為材料，結(jié)合最近釋放的雷蒙德氏棉全基因組信息以及不同棉種EST序列信息，進(jìn)行棉花D

3、基因組中Hsp70基因的鑒定、分類和黃萎病菌誘導(dǎo)后的表達(dá)分析，從而為我國(guó)棉花抗黃萎病育種提供高效抗源，并為棉花抗黃萎病基因的表達(dá)調(diào)控以及棉花抗黃萎病機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1轉(zhuǎn)天麻抗真菌蛋白基因提高棉花對(duì)黃萎病的抗性
　　天麻抗真菌蛋白基因（gastrodia antfungal protein，gafp）是一個(gè)從天麻體內(nèi)克隆得到的抗病基因，其開放閱讀框全長(zhǎng)為540bp，編碼179個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)A

4、F225410。本研究利用pBI121質(zhì)粒載體為基礎(chǔ)構(gòu)建CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gafp基因植物高效表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化陸地棉高頻再生品系蘇研060，培育出22個(gè)轉(zhuǎn)gafp基因純合系。Southern blotting結(jié)果表明，每1個(gè)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)有1-2個(gè)拷貝gafp基因整合到棉花基因組中。RT-PCR分析、Western blotting等分子檢測(cè)結(jié)果證明，gafp基因在16個(gè)純合系中能夠正確地實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯，目的基因已

5、經(jīng)整合到棉花基因組中，并能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物天麻抗真菌蛋白。通過溫室苗期接菌鑒定與網(wǎng)室成株期病土鑒定，篩選獲得3個(gè)抗黃萎病的棉花新種質(zhì)系TG809、TG816、TG823，這3份新種質(zhì)對(duì)落葉型黃萎病菌系V991的抗性穩(wěn)定達(dá)到抗級(jí)。研究結(jié)果表明，gafp基因轉(zhuǎn)化陸地棉能夠顯著提高棉花對(duì)黃萎病的抗性。
　　2陸地棉背景野生棉染色體片段代換系培育與抗黃萎病種質(zhì)資源發(fā)掘
　　通過陸地棉與異常棉、辣根棉、旱地棉、雷蒙德氏棉、黃褐棉等

6、野生棉的遠(yuǎn)緣雜交和回交等，育成65份陸地棉背景的野生棉染色體片段代換系。兩年性狀鑒定結(jié)果表明，野生棉染色體片段代換系的株高平均值與陸地棉品種處于相同水平，單株果枝數(shù)、單株果節(jié)數(shù)、單株結(jié)鈴數(shù)、鈴重、衣分平均值均低于陸地棉品種。其中辣根棉、雷蒙德氏棉染色體片段代換系的單株結(jié)鈴數(shù)高于旱地棉、異常棉、黃褐棉染色體片段代換系;黃褐棉、辣根棉染色體片段代換系的鈴重平均值高于旱地棉、異常棉、雷蒙德氏棉染色體片段代換系;辣根棉、雷蒙德氏棉、黃褐棉染色體

7、片段代換系的衣分平均值高于異常棉、旱地棉染色體片段代換系。異常棉、辣根棉、旱地棉、雷蒙德氏棉、黃褐棉染色體片段代換系單株皮棉產(chǎn)量水平低，僅占陸地棉推廣品種的44.17％-64.16％。野生棉染色體片段代換系纖維長(zhǎng)度、比強(qiáng)度、細(xì)度與成熟度搭配合理，大多數(shù)品系的纖維適宜紡80支以上的特高支紗，目前大面積推廣的陸地棉品種主要纖維品質(zhì)指標(biāo)搭配不合理，比強(qiáng)度普遍偏低，大多數(shù)品種只能紡中低支紗，不能滿足棉紡織工業(yè)的用棉需求。根據(jù)連續(xù)兩年落葉型黃萎病

8、菌系V991人工病圃抗病性鑒定結(jié)果，從65份陸地棉背景的野生棉染色體片段代換系中，獲得5份抗黃萎病的棉花新種質(zhì)系，其中蘇遠(yuǎn)040、蘇遠(yuǎn)045、蘇遠(yuǎn)061病情指數(shù)分別為8.33、4.35、7.79，高抗黃萎病，蘇遠(yuǎn)030、蘇遠(yuǎn)034病情指數(shù)分別為12.35、13.70，抗黃萎病。追蹤陸地棉抗黃萎病新種質(zhì)系的親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，蘇遠(yuǎn)040、蘇遠(yuǎn)045為雷蒙德氏棉染色體片段代換系，蘇遠(yuǎn)061為黃褐棉染色體片段代換系，蘇遠(yuǎn)030、蘇遠(yuǎn)034為旱地棉染

9、色體片段代換系。這些高品質(zhì)纖維、抗黃萎病新種質(zhì)的育成，拓寬了陸地棉的遺傳基礎(chǔ)，為我國(guó)棉花新品種選育實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)性狀的同步改良提供了骨干親本。
　　3棉花D基因組熱激蛋白70基因的鑒定與黃萎病菌脅迫后的表達(dá)分析
　　熱激蛋白(HSP，heat shock protein)是細(xì)胞受到不利環(huán)境刺激時(shí)被激活并增強(qiáng)表達(dá)的一類蛋白，其中HSP70在植物逆境脅迫應(yīng)答、分子伴侶作用及其提高植物抗逆性的過程中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)表達(dá)特性可將HS

10、P70家族分為HSC70和HSP70，前者屬于結(jié)構(gòu)型HSP，在所有細(xì)胞內(nèi)都能表達(dá)，同時(shí)也受一定程度的熱誘導(dǎo);后者屬于誘導(dǎo)型HSP，在正常情況下很少表達(dá)或不表達(dá)，而在熱刺激或其它環(huán)境脅迫下表達(dá)量迅速增強(qiáng)。本研究利用最近釋放的雷蒙德氏棉全基因組序列信息，對(duì)棉花D基因組中的Hsp70基因家族進(jìn)行鑒定、分類和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，共獲得30個(gè)Hsp70基因，這些基因非均勻性地分布在棉花D基因組染色體上，在D4、D7染色體上沒有分布，同時(shí)發(fā)現(xiàn)1

11、2個(gè)Hsp70基因以不同組合方式成簇分布在D6、D9、D11和D12染色體上。參照擬南芥Hsp70基因的分類方法，將棉花D基因組30個(gè)Hsp70基因分為兩個(gè)家族，其中24個(gè)屬于DnaK基因家族，6個(gè)屬于Hsp110/SSE基因家族。根據(jù)亞細(xì)胞定位結(jié)果，將棉花D基因組30個(gè)Hsp70基因分為6個(gè)亞組。其中第1亞組11個(gè)，定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì);第2亞組5個(gè)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng);第3亞組3個(gè)，定位于線粒體;第4亞組3個(gè)，定位于葉綠體;第5亞組兩個(gè)，未能

12、定位于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);第6亞組6個(gè)，屬于Hsp110/SSE基因家族，定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。利用蘇遠(yuǎn)045、海7124和TM-1為供試材料，其中蘇遠(yuǎn)045高抗黃萎病，海7124抗黃萎病，TM-1感黃萎病。在落葉型黃萎病菌系V991脅迫條件下，開展棉花Hsp70基因的表達(dá)特征研究。結(jié)果表明，除Hsp70-07、Hsp70-16、Hsp70-25和Hsp70-26基因的表達(dá)不受黃萎病菌誘導(dǎo)外，其它26個(gè)Hsp70基因均受黃萎病菌的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，H

13、sp70基因在棉花黃萎病脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。受黃萎病菌誘導(dǎo)24h后，Hsp70-02、Hsp70-08、Hsp70-09、Hsp70-18、Hsp70-19、Hsp70-30基因在蘇遠(yuǎn)045體內(nèi)高效表達(dá);Hsp70-08、Hsp70-10、Hsp70-11、Hsp70-18、Hsp70-30基因在海7124體內(nèi)高效表達(dá)，這些Hsp70基因可能與棉花抗黃萎病的入侵有關(guān)。接種黃萎病菌144h后，Hsp70-13、Hsp70-14、