不同金屬離子誘導(dǎo)枸杞體細胞胚發(fā)生及枸杞多倍體培育研究.pdf

1、植物體細胞胚發(fā)生的機理研究和多倍體誘導(dǎo)的技術(shù)優(yōu)化一直是植物分子及細胞生物學(xué)中的兩個熱點問題。已有的研究表明，不同價位金屬離子分別對寧夏枸杞(Lycium barbarum L．)體細胞胚發(fā)生的調(diào)節(jié)效應(yīng)和作用機制差異顯著，但在同一條件下的比較試驗嚴重不足，且以體細胞胚為基底的同源四倍體誘導(dǎo)非常少見。本研究以寧夏枸杞代表品種一寧紅1號為試驗材料，以不同價位的金屬離子Ag+、Ca2+和Eu3+的可溶性化合物按照不同濃度梯度作為外源影響因子，試

2、驗研究了三種不同外植體根基部、莖和葉切塊體細胞胚發(fā)生的效率和相對生長速率；同時試驗比較了體細胞胚、愈傷組織和激活種子在不同濃度梯度的秋水仙素和DMSO混合液誘導(dǎo)下枸杞同源四倍體發(fā)生效率，并對育成的同源四倍體進行了細胞學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。以上兩個方面為今后枸杞體細胞胚誘導(dǎo)的高效體系的建立和植物同源多倍體技術(shù)優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)，為將來名貴中藥材高效同質(zhì)多倍體的培育、減少或避免嵌合體干擾的產(chǎn)生、提高誘變效率提供實踐途徑。主要試驗結(jié)果如下：

3、1.枸杞無菌苗長至3-4片真葉后，將根基部、莖和葉切成小塊，在MS+2，4-D0.2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)真葉被誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織長勢最好、相對生長速率最高，轉(zhuǎn)入無激素MS培養(yǎng)基時得到的體細胞胚數(shù)最多。葉愈傷組織比起根基部和莖被誘導(dǎo)得到的愈傷組織質(zhì)地緊密，相對生長速率達到0.04g/(d·外植體)、而根基部和莖的都是0.02g/(d·外植體)；轉(zhuǎn)入無激素MS培養(yǎng)基15天時，每塊胚性愈傷組織所誘導(dǎo)的體細胞胚數(shù)分別

4、是根39.1個、莖42.8個、葉44.9個。 2.根基部、莖和葉為外植體誘導(dǎo)得到的愈傷組織在含2，4-D 0.2mg/L的MS培養(yǎng)基上4次繼代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入含不同濃度梯度的Ag+、Ca2+和Eu3+三種外源離子的MS培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)三種離子在低濃度情況下均可促進愈傷組織的體細胞胚發(fā)生，而高濃度抑制體細胞胚的形成，且體細胞胚數(shù)在三種外植體中具有相同的變化趨勢。當Ag+濃度為1mg/L時，每塊葉愈傷組織形成的體細胞胚數(shù)為對照組

5、的2倍多，Ca2+和Eu3+在其較適宜濃度下均無達到這個水平。 3.枸杞多倍體誘導(dǎo)： 愈傷組織：枸杞無菌苗葉片在MS+0.1mg/L6BA+0.5mg/LNAA激素條件下誘導(dǎo)出來的無綠色芽點、質(zhì)地緊密的愈傷組織為試驗材料，在0.2％秋水仙素和2％DMSO混合液處理48h時誘導(dǎo)率高達66.7％，且嵌合體少、同質(zhì)性高，是較好的枸杞多倍體誘導(dǎo)的方法。 激活種子：將枸杞種子經(jīng)常規(guī)消毒后浸于無菌水中，待種子露白時用0.2％

6、秋水仙素和2％DMSO混合液浸泡24h時誘導(dǎo)率最高達8％，但嵌合體現(xiàn)象嚴重，多倍體的特征不穩(wěn)定，表現(xiàn)出不同程度的回復(fù)突變。 體細胞胚：枸杞無菌苗葉片在含0.2mg/L2，4-D的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出來的愈傷組織在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4次后，轉(zhuǎn)入不含激素的MS培養(yǎng)基上分化10天所得到的球形胚為試驗材料，在20mg/L秋水仙素和1％DMSO混合液處理24h時誘變率6％、無嵌合體現(xiàn)象。本文首次報道，在體細胞胚的離體條件下，通過秋水仙素處

7、理誘導(dǎo)獲得了枸杞同源四倍體。 4.染色體計數(shù)鑒定表明，正常二倍體植株染色體數(shù)為24，所得到的四倍體植株染色體增加一倍，為48條染色體。 5.從形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)方面對四倍體植株和二倍體植株進行了比較。結(jié)果顯示，形態(tài)上四倍體比二倍體植株根系較少，但粗壯。四倍體植株與二倍體植株在氣孔大小、頻度具極顯著差異。在40倍鏡下，四倍體氣孔長度31.9μm，二倍體植株氣孔長度24.3μm；四倍體寬度29.0μm，二倍體寬度23.9μm。而在10倍