ATF4與正畸牙周組織改建相關(guān)的實驗研究.pdf

1、背景和目的 在正畸治療過程中，機械力作用于牙齒，引起牙周組織改建，最終使牙齒發(fā)生移動而達到矯治目的。這種正畸治療的生理介質(zhì)是牙周膜，它是具有成骨能力的骨／牙界面，是一種變異的骨膜，具有明顯的骨吸收和骨形成能力。在正畸臨床中，沒有牙周膜的粘連牙不能發(fā)生移動，這也提示我們，在牙槽骨改建的過程中，牙周膜起到至關(guān)重要的作用。正畸牙齒受力后的牙周膜組織表現(xiàn)為受壓側(cè)破骨細胞聚集、功能活躍，牙槽骨吸收，受牽張側(cè)成骨細胞生成、行使功能，牙槽骨改

2、建，骨形成。破骨細胞來源于造血組織中的破骨細胞前體，是骨吸收的唯一細胞；成骨細胞來源于牙周膜自身，不僅是骨形成的主要細胞，而且在破骨細胞的附著、促進破骨細胞前體分化和合成破骨細胞骨吸收刺激因子等方面起作用。已有研究證實牙周膜細胞中包含具有分化潛能的成纖維細胞群體，正畸機械力能誘導其表達一些成骨細胞的表型和功能蛋白，向成骨樣細胞分化。牙周膜細胞分化為成骨細胞，參與骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的關(guān)鍵。 牙周膜細胞在機械力作用下向成骨

3、細胞分化的分子機制比較復雜，包含多條信號轉(zhuǎn)導途徑。例如，一氧化氮(NO)、前列腺素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)、百日咳毒素敏感異源三聚體G蛋白(PTX-敏感蛋白)、動力敏感鈣離子通道等。近年的研究表明，一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子也參與了細胞內(nèi)調(diào)控途徑，將細胞外物理或機械刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細胞反應(yīng)。 1987年，能以一個共同的核心序列(CGTCA)和腺病毒啟動子E2，E3和E4結(jié)合的蛋白被命名為ATF，在隨后的幾年中發(fā)現(xiàn)了大量相

4、同的或者類似的能和ATF/CRE位點結(jié)合的蛋白，這些蛋白都含有一個命名為bZip的DNA結(jié)合區(qū)域?；谒麄兊陌被岬南嗨菩?，ATF家族被分為ATF2，ATF4，ATF6，B-ATF亞類。 1989年，Hai根據(jù)ATF/CREB結(jié)合序列特異性識別位點，首次克隆了ATF4。其他的學者也相繼分離出了ATF4，它通常又被稱為TAXREB67、 CREB2或C/ATF。研究表明，ATF4與成骨細胞特異性基因骨鈣素啟動區(qū)的成骨細胞特異性元件1(OS

5、E1)相結(jié)合，調(diào)控成骨細胞的分化。至今為止，只有Runx2和ATF4可誘導非成骨細胞系表達成骨細胞特異型基因骨鈣素的表達。另外，有研究證實ATF4是RSK2的磷酸化底物，ATF4(-/-)鼠出現(xiàn)CLs表現(xiàn)型，除精神發(fā)育遲緩外，還伴有顱面、牙齒、骨骼發(fā)育異常。ATF4和RSK2以一種線性級聯(lián)的方式調(diào)控成骨細胞分化和功能，是間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化所必需的。ATF4作為成骨細胞分化的關(guān)鍵因子，與骨發(fā)育和牙齒發(fā)育關(guān)系的研究正在不斷開展。但正畸

6、骨改建與骨發(fā)育是兩種不同的生理過程，ATF4在正畸牙齒移動牙周組織的表達和分布，在機械力的作用下體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞中表達變化的情況，以及在牙周膜細胞向成骨樣細胞分化的過程中所起的作用，國內(nèi)外尚未有報道。 本研究通過建立正畸大鼠牙齒移動動物模型和體外細胞培養(yǎng)，結(jié)合細胞力學試驗方法和分子生物學測試技術(shù)，擬從組織、細胞水平以及分子生物學角度探討ATF4在正畸牙齒移動過程中對牙周組織改建的影響及作用機制，進一步為正畸牙齒移動提供理論

7、和實踐依據(jù)。 方法 1.觀察正畸牙周組織改建過程中ATF4的表達變化建立大鼠牙齒移動實驗?zāi)Ｐ停诩恿?h，2h，4h，8h，12h，ld，3d，5d，7d后，處死大鼠，固定，脫鈣，制作大鼠第一磨牙牙周組織石蠟切片，HE染色觀察牙周組織形態(tài)學變化，免疫組化進行半定量分析ATF4的表達。 2.觀察機械力加載下人牙周膜細胞ATF4mRNA和蛋白的表達變化組織塊法培養(yǎng)原代人牙周膜細胞，并做波形絲蛋白抗體和角蛋白抗體染色鑒

8、定。取4-6代生長旺盛，性質(zhì)穩(wěn)定的人牙周膜細胞進行實驗。以2.5×10<'5>/孔將第4代人牙周膜細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時，換用含2﹪胎牛血清的條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，將六孔板置于離心加力支架中，離心機加力10min，30 min，60min，90min，120min，240min(910rev/min，約167g相對離心力)。提取總RNA和核蛋白，以半定量RT-PCR和Western Blotting檢測ATF4mRN

9、A和蛋白的表達變化。 3．觀察ATF4在牙周膜細胞向成骨樣細胞分化過程中的作用5﹪CO2，37℃條件下，生長狀態(tài)良好的4-6代人牙周膜細胞培養(yǎng)于10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。按陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM說明操作，用美國腫瘤研究所Professor Lee惠贈的重組質(zhì)粒pMyc-ATF4和空載體質(zhì)粒pCMV5-myc轉(zhuǎn)染人牙周膜細胞。半定量RT-PCR和Western Blotting檢測未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒

10、(pCMV5-myc)細胞、轉(zhuǎn)染目的基因(pMyc-ATF4)細胞ATF4mRNA和蛋白表達水平。三組細胞均加載30min 167g離心力，檢測ALP活性及成骨樣基因骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)、膠原Ⅰ(COLI)、骨涎蛋白(BSP)基因的表達變化。 結(jié)果 1．正常大鼠的牙周組織中基本上未見有明顯的ATF4的陽性表達，靠近牙骨質(zhì)和牙槽骨表面的牙周膜部分輕度染色，而中間部分的牙周膜染色更淺。正畸加力組大鼠牙周組織中

11、ATF4表達增強，表達貫穿正畸牙周組織改建的全過程。在壓力側(cè)，靠近牙骨質(zhì)表面的牙周膜強陽性表達；在張力側(cè)，靠近牙骨質(zhì)和牙槽骨表面的牙周膜區(qū)域強陽性表達，中間部分的牙周膜也陽性表達；所有加力組大鼠張力區(qū)比壓力區(qū)陽性染色深，骨形成區(qū)域陽性染色較強。 2．正常人牙周膜細胞有ATF4．mPNA表達：加載167g離心力后，ATF4 mPdqA表達發(fā)生變化：加力10min時開始增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；加力30min時達到高峰(

12、P<0.01)；加力60min，90min時表達開始下降，但仍高于加力前水平(P<0.01)；加力120min時降至加力前水平(P>0.05)。 正常人牙周膜細胞ATF4蛋白表達很低；加載167g離心力后，ATF4蛋白表達發(fā)生變化：加力10min時開始增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；加力30min時繼續(xù)增加(P<0.01)；加力50min時達到高峰(P<0.01)，加力90min時表達開始下降，但仍高于加力前水平(P<0.

13、01)；加力120min時降至加力前水平(P>0.05)。 3．人牙周膜細胞表達ALP，轉(zhuǎn)染目的基因pMyc-ATF4后，ALP表達活性升高(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV5-myc ALP表達未發(fā)生明顯變化(NS：P>0.05)。未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pCMV5-myc、轉(zhuǎn)染pMyc-ATF4人牙周膜細胞受到167g離心力，ALP表達均升高(*P<0.05，**P<0.01)；但轉(zhuǎn)染pCMV5-myc與未轉(zhuǎn)染細胞相比，受力后ALP

14、表達無明顯差異(NS：P>0.05)，轉(zhuǎn)染pMyc-ATF4與未轉(zhuǎn)染細胞相比，受力后ALP表達升高(P<).01)。人牙周膜細胞有OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA表達，沒有OCNmRNA表達。轉(zhuǎn)染目的基因pMyc-ATF4后，OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表達均升高(*P<0.05，料P<0.01)，但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV5-myc后，OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OC

15、NmRNA表達未發(fā)生明顯變化(NS：P>0.05)。未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pCMV5-myc、轉(zhuǎn)染pMyc-ATF4細胞受到167g離心力，OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表達均升高(*P<0.05，**P<0.01)；但轉(zhuǎn)染pCMV5-myc與未轉(zhuǎn)染細胞相比，受力后OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表達無明顯差異(NS：P>0.05)，轉(zhuǎn)染pMyc-ATF4與未轉(zhuǎn)染細胞相比，受力后O

16、PNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表達升高(P<0.01)。 結(jié)論 1．ATF4在正畸牙齒移動過程中的表達有明顯的變化，從而確定其參與了牙齒移動過程中的牙周組織的改建，在正畸牙齒移動的機制中具有重要意義。 2．應(yīng)力刺激可使ATF4mRNA及蛋白的表達增強，表達量在30分鐘N60分鐘左右達到峰值，隨后逐漸降低至正常水平；表明ATF4可對力學刺激作出快速、一過性的短暫表達反應(yīng)。從細胞水平證