豬流行性腹瀉病毒傳統(tǒng)毒株和變異毒株P(guān)CR鑒別診斷方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，病原為豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)。2010年底以來(lái)，我國(guó)南方多省暴發(fā)PED，仔豬感染率達(dá)100％，致死率80％～100％，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，研究人員通過分離PEDV流行毒株和全基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，流行毒株與傳統(tǒng)毒株CV777相比，基因

2、組變異較大，尤其是S基因，存在堿基插入、缺失和突變。本研究根據(jù)PEDV傳統(tǒng)毒株和變異毒株S基因特征，并參照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法，設(shè)計(jì)合成了引物，建立了可以同時(shí)鑒別PEDV流行毒株和傳統(tǒng)毒株的real-time PCR和RT-PCR方法，并將兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，兩種方法均可鑒別診斷PEDV傳統(tǒng)毒株和變異毒株，real-time PCR更為敏感。
　　本研究具體內(nèi)容如下:
　　1.PEDV傳統(tǒng)毒株和變異毒株P(guān)CR鑒別檢測(cè)方

3、法的建立
　　本研究根據(jù)PEDV傳統(tǒng)毒株和變異毒株S基因序列，并參照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法，設(shè)計(jì)合成了引物，通過部分條件的優(yōu)化，分別建立了能鑒別兩種毒株的real-time PCR和RT-PCR方法。通過敏感性、重復(fù)性、特異性等試驗(yàn)對(duì)兩種方法進(jìn)行了比較。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:兩種PCR方法均可以鑒別診斷PEDV傳統(tǒng)毒株和變異毒株，并能區(qū)分PEDV與其他病毒，具有良好的特異性;常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)PEDV傳統(tǒng)毒株和變異毒株的最小濃度均

4、為4×105copies/μl，real-time PCR方法檢測(cè)傳統(tǒng)毒株和變異毒株的最小濃度為4×102copies/μl，是常規(guī)RT-PCR敏感性的1000倍;real-time PCR方法，起始模板濃度與Ct值之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.996;重復(fù)性試驗(yàn)中，real-time PCR變異系數(shù)小于2‰用常規(guī)RT-PCR對(duì)4份樣品進(jìn)行三次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，兩種方法均可以鑒別診斷PEDV的傳統(tǒng)毒株和變異

5、毒株，并具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。通過比較，real-time PCR方法具有更好的敏感性。
　　2.兩種PCR方法的臨床應(yīng)用
　　為比較兩種PCR方法的臨床應(yīng)用效果，分別用real-time PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法對(duì)采集的72份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下:real-time PCR方法檢測(cè)到51份陽(yáng)性，其中傳統(tǒng)毒株12份，變異毒株39份;常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)到26份陽(yáng)性，其中傳統(tǒng)毒株3份，變異毒株23