乳香膠抗幽門螺桿菌成份活性評(píng)價(jià)與作用機(jī)理研究.pdf

1、背景 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.ylori)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌、胃粘膜組織淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因素，世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌因子。對(duì)于Hp的治療，現(xiàn)階段臨床上主要應(yīng)用抗生素加H<'+>拮抗劑或鉍劑的三聯(lián)療法，但存在明顯不足，包括療效欠穩(wěn)定，易復(fù)發(fā)與再感染；易產(chǎn)生耐藥性；醫(yī)療費(fèi)用較高等。其中Hp對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致抗Hp感染治療失敗的重要原因。因此，研究者致力

2、于尋求高效低毒不易產(chǎn)生耐藥性的新藥與新方法。 乳香膠(Mastic Gum，MG)是從漆樹(shù)科植物粘膠乳香樹(shù)的根和葉中獲得的一種樹(shù)脂滲出液，為多種成份的混合物，在許多國(guó)家被作為食品添加劑使用。研究認(rèn)為它無(wú)毒無(wú)刺激，沒(méi)有明顯的副作用，對(duì)Hp感染所致胃潰瘍有治療作用。體外研究發(fā)現(xiàn)MG內(nèi)有抗菌成份，而具體是哪一種或者哪幾種成份發(fā)揮對(duì)Hp的治療作用還未見(jiàn)報(bào)道。 目的 通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，從已發(fā)現(xiàn)的未做抗Hp研究的MG成份中選擇多

3、種成份，進(jìn)行抗Hp作用的體外實(shí)驗(yàn)研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單個(gè)成份體內(nèi)清除治療Hp的實(shí)驗(yàn)，以期發(fā)現(xiàn)有效的抗Hp候選藥物。并對(duì)所篩選到的單體成份進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)與消除實(shí)驗(yàn)、聯(lián)合藥物敏感實(shí)驗(yàn)及初步的毒理學(xué)評(píng)價(jià)；同時(shí)，通過(guò)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和粘附抑制實(shí)驗(yàn)，探討其抗Hp的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。 方法 1．采用紙片擴(kuò)散法和肉湯稀釋法進(jìn)行10種乳香膠活性成份(α-萜品醇、馬鞭草烯酮、芳樟醇、檸檬烯、β-石竹烯、甲基異丁子香酚、γ-萜品烯、

4、反式茴香烯、香葉烯、麝子油醇)抗Hp的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，初篩出藥效較好成份測(cè)定其MIC和MBC。在此基礎(chǔ)上，對(duì)MIC值最小的成份進(jìn)行MIC<,50>、MIC<,90>．、MBC<,50>、MBC<,90>的測(cè)定。 2．應(yīng)用Hp感染動(dòng)物模型，用PCR法、培養(yǎng)法、病理學(xué)方法檢測(cè)Hp的感染率。用篩選出的候選成份進(jìn)行Hp清除治療試驗(yàn)，并以臨床一線三聯(lián)療法(奧美拉唑+克拉霉素+甲硝唑)為陽(yáng)性藥物對(duì)照，以溶劑為陰性對(duì)照，每組20只BALB/c小

5、鼠，每天1次，連續(xù)灌胃14天。分別在用藥的第8天，停藥后1天，停藥后30天，檢測(cè)Hp的清除率，從而判斷藥物治療效果。進(jìn)一步對(duì)藥物效果最好的組份進(jìn)行劑量分組治療，同上方法處理，確立其有效劑量。 3．藥物特性與毒理學(xué)研究。將上面篩到的藥物效果最佳的組份在1/2MIC的含該成份平板上連續(xù)傳代14代，用肉湯稀釋法監(jiān)測(cè)其MIC值的變化，觀察該成份的誘導(dǎo)耐藥性；將誘導(dǎo)耐藥株在不含藥物的平板上連續(xù)傳代14代，用肉湯稀釋法監(jiān)測(cè)其MIC值的變化

6、，觀察耐藥的穩(wěn)定性；肉湯稀釋法檢測(cè)反式茴香烯對(duì)誘導(dǎo)耐藥株的敏感性，觀察其交叉耐藥性；采用試管棋盤方陣法進(jìn)行三種藥效最佳成份的體外聯(lián)合藥物敏感實(shí)驗(yàn)；將反式茴香烯于4℃、常溫(25℃)、37℃存放18個(gè)月，監(jiān)測(cè)藥物對(duì)Hp的MIC值變化。最大限量實(shí)驗(yàn)法結(jié)合LD<,50>)法，觀察該成份對(duì)BALB/c小鼠的急性毒性，記錄小鼠的一般狀況，死亡狀況和病理解剖狀況，評(píng)價(jià)其安全性。 4．液體培養(yǎng)Hp，加入反式茴香烯，分別用光鏡和電鏡觀察其作用后

7、Hp形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化；培養(yǎng)胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞，在生長(zhǎng)至80％時(shí)，分別加入Hp和經(jīng)1/2MIC濃度該成份處理5h的Hp，油鏡下觀察Hp與GES-1的粘附作用。 結(jié)果 1．所選擇的10種成份中，除香葉烯和麝子油醇外，均有一定抑菌效果，其中β-石竹烯、芳樟醇、γ-萜品烯、α-萜品醇、反式茴香烯效果明顯，它們對(duì)Hp NCTC11637的MIC分別為625μg/ml、156μg/ml、156μg/ml、625μg/ml、39

8、μg/ml；藥效最好的三種藥物為芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯；反式茴香烯對(duì)Hp的MIC<,50>為39μg/ml，MIC90為78μg/ml，MBC<,50>為78μg/ml，MBC<,90>為156μg/ml。 2．Hp感染BALB/c小鼠動(dòng)物模型的感染率達(dá)100％(8/8)。治療第8d，芳樟醇組和γ-萜品烯組的清除率和溶劑對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，反式茴香組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組的清除率和溶劑對(duì)照組有顯著差異(P<0．

9、05)；停藥后第1d，停藥后第30d，各治療組與溶劑對(duì)照組均有顯著性差異。在治療的第8d，各治療組的清除率均低于50％(3/6)；而在停藥后第1d，其清除率均超過(guò)66．7％(4/6)，γ-萜品烯和反式茴香烯甚至達(dá)到83.3％(5/6)；停藥后第30d，三種候選單體藥物組的清除率與停藥后第1d相比無(wú)顯著差別(P<0.05)。進(jìn)一步進(jìn)行的反式茴香烯抗Hp有效劑量研究，結(jié)果顯示反式茴香烯對(duì)Hp的清除治療效果和藥物劑量成正相關(guān)，其在250mg/

10、kg時(shí)清除治療效果和陽(yáng)性藥物對(duì)照組相同。 3．藥物特性與毒理學(xué)研究結(jié)果。耐藥誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反式茴香烯連續(xù)誘導(dǎo)14代未能誘導(dǎo)出Hp的耐藥株，且其對(duì)甲硝唑誘導(dǎo)的耐藥株仍有效；對(duì)藥效尤其明顯的芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯進(jìn)行聯(lián)合藥物敏感實(shí)驗(yàn)，其FIC值分別為1.5、2．0、1.5，相互作用為無(wú)關(guān)作用；于4℃、常溫(25℃)、37℃存放18個(gè)月，反式茴香烯對(duì)Hp的MIC值不變；急性口服毒性實(shí)驗(yàn)表明，芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯的LD<

11、,50>均小于5000 mg/kg；反式茴香烯的LD<,50>為3086 mg/kg，治療指數(shù)TI>20.6。在低劑量時(shí)，肝腎功能及胃腸未見(jiàn)明顯變化，劑量達(dá)5000mg/kg時(shí)，可見(jiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，肺部出現(xiàn)病理改變。 4．光鏡和電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，反式茴香烯作用后Hp形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Hp細(xì)胞腫脹壞死，細(xì)胞膜破裂甚至缺失，導(dǎo)致內(nèi)容物溢出，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，變化越來(lái)越明顯；Hp粘附實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)反式茴香烯處理后的

12、Hp失去其與胃上皮細(xì)胞的粘附能力。 結(jié)論 1．芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯為MG中的抗Hp有效組份，均有良好的體內(nèi)外抗Hp活性，其中反式茴香烯尤為突出，可以作為Hp治療的候選替代藥物進(jìn)一步研究。 2．反式茴香烯不易誘導(dǎo)Hp耐藥，與甲硝唑無(wú)交叉耐藥性，于4℃、常溫(25℃)、37℃存放時(shí)，其抗Hp活性穩(wěn)定。 3．反式茴香烯作為抗Hp藥物的劑量使用在BALB/c小鼠中沒(méi)有急性毒性，使用安全；超高劑量時(shí)導(dǎo)致肝