SGK1在早期糖尿病腎病中作用的探索性研究.pdf

1、第一部分:血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶在高糖誘導(dǎo)的人類腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá) 目的:研究高糖環(huán)境下人類近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)中血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶(SGK)3種亞型SGK1，SGK2和SGK3的表達(dá)，并探討其在介導(dǎo)高糖致腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的作用。 方法:將HKC分為三組：1)正常對(duì)照組(NG組，含5.5mmol/LD-葡萄糖)；2)高糖組(HG組，含25mmol/LD-葡萄糖

2、)；3)滲透壓對(duì)照組(MG組，含19.5mmol/L甘露醇和5.5mmol/LD-葡萄糖，終濃度25mmol/L)分別刺激2h和8h，采用RT-PCR方法和Westernblot方法檢測(cè)SGK1，SGK2，SGK3mRNA水平和SGK1蛋白水平的表達(dá)，ELISA方法和間接免疫熒光方法檢測(cè)培養(yǎng)液中和HKC胞漿內(nèi)纖連蛋白(FN)的含量。 結(jié)果:HKC細(xì)胞中存在SGK1，SGK2和SGK3的表達(dá)。高糖刺激下，SGK1，SGK2，SGK

3、3mRNA和SGK1蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)；同時(shí)伴有HKCFN合成和分泌的增加，這與SGK上調(diào)存在一定聯(lián)系。 結(jié)論:高糖能促進(jìn)人近端腎小管上皮細(xì)胞SGK1，SGK2和SGK3的表達(dá)，并可能通過(guò)SGK1，SGK2和SGK3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚，可能在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮致病作用。 第二部分:SGK1超表達(dá)對(duì)人足細(xì)胞纖連蛋白表達(dá)的影響 目的:研究高糖刺激對(duì)人足細(xì)胞SGK1表達(dá)的影

4、響，以及SGK1超表達(dá)和滅活條件下，足細(xì)胞纖連蛋白的分泌水平，從正反兩方面揭示SGK1在誘導(dǎo)足細(xì)胞ECM聚集，引發(fā)糖尿病腎病腎纖維化過(guò)程中的作用。 方法:高糖刺激人足細(xì)胞8h，Westernblot方法檢測(cè)SGK1蛋白水平的表達(dá)。利用構(gòu)建好的SGK1激活型質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-SGK1SD)，滅活型質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-SGK1KN)和空載體(pIRES2-EGFP)轉(zhuǎn)染人的足細(xì)胞，然后給予高糖刺激。免疫熒光方法

5、和Westernblot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后足細(xì)胞合成和分泌纖連蛋白的水平，以及高糖刺激對(duì)它的影響。 結(jié)果:人足細(xì)胞中存在SGK1的表達(dá)，高糖刺激后SGK1表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。SGK1SD轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞FN分泌明顯增加，再予高糖刺激FN上調(diào)并不明顯；相反，SGK1KN轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞中FN分泌明顯減少(P＜0.01)，高糖刺激下FN表達(dá)增加(P＜0.01)；對(duì)照組空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞受高糖刺激后FN表達(dá)亦顯著上調(diào)(P＜0.01)。

6、 結(jié)論:SGK1參與了高糖誘導(dǎo)的人足細(xì)胞FN的合成，可能在糖尿病腎病早期足細(xì)胞的受損活化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 第三部分:SGK1基因敲除鼠早期糖尿病腎病腎生理改變的研究 目的:追蹤檢測(cè)早期糖尿病腎病中SGK1基因敲除鼠腎臟生理特征的改變，進(jìn)一步闡明SGK1的功能以及SGK1在早期糖尿病腎病腎纖維化中發(fā)揮的作用。 方法:采用定量PCR方法檢測(cè)6對(duì)野生型(WT)鼠和基因敲除鼠(KO)腎臟SGK2和SGK3的表達(dá)。

7、將野生型(sgk+/+)和SGK1基因敲除鼠(sgk-/-)隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病模型組，制作STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病腎病模型，共分以下4組：①sgk+/+正常對(duì)照組(WT-NC組，n=4)；②sgk+/+糖尿病組(WT-DC組，n=6)；③sgk-/-正常對(duì)照組(KO-NC組，n=4)；④sgk-/-糖尿病組(KO-DC組，n=6)。定期采血，作代謝箱，收集糖尿病8周病程不同時(shí)間點(diǎn)的血、尿標(biāo)本用于血、尿電解質(zhì)(Na+，K+，Ca2+

8、)，血糖和血紅蛋白，尿量和尿滲透壓，腎小球?yàn)V過(guò)率以及尿總蛋白和白蛋白的檢測(cè)。處死后稱取腎臟重量，計(jì)算腎重指數(shù)。 結(jié)果:sgk-/-鼠腎臟SGK2和SGK3的表達(dá)與sgk+/+鼠無(wú)明顯差異。WT-DC組和KO-DC組血Na+，K+，Ca2+濃度與相應(yīng)NC組無(wú)明顯差異，但血糖和血紅蛋白均較相應(yīng)NC組明顯升高(P＜0.01)。WT-DC組和KO-DC組尿Na+、K+、Ca2+、尿量、腎小球?yàn)V過(guò)率、尿總蛋白含量、尿白蛋白含量以及腎重指數(shù)

9、均較相應(yīng)NC組顯著升高(P＜0.01)，尿滲透壓明顯降低(P＜0.01)。更為重要的是，KO-DC組尿總蛋白和尿白蛋白含量均明顯低于WT-DC組(P＜0.01)，其他參數(shù)兩組未見(jiàn)明顯差異。 結(jié)論:SGK1基因敲除后，SGK另外兩種亞型SGK2和SGK3表達(dá)沒(méi)有代償性上調(diào)，它們可能在在生命體中扮演了不同的角色。SGK1基因敲除可減少早期糖尿病腎病中蛋白尿的產(chǎn)生，對(duì)腎臟是一種保護(hù)性作用，從體內(nèi)直接證實(shí)了SGK1參與了早3期糖尿病腎病