鴨瘟強(qiáng)毒TK基因的原核表達(dá)及在感染鴨組織亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的鴨瘟病毒(DPV)TK基因(GenBank登錄號(hào)DQ640611)設(shè)計(jì)并合成了特異性引物，對(duì)DPVTK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析，并開(kāi)展了TK基因原核表達(dá)及其免疫原性檢測(cè)，間接免疫過(guò)氧化物酶組織化學(xué)染色法(IISM)和間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)DPVTK基因表達(dá)產(chǎn)物方法的建立及其在人工感染鴨體內(nèi)表達(dá)定位的系列研究，獲如下結(jié)果： 1.DPVTK基因分子特性該基因含1077bp，編碼358aa。

2、TK蛋白含有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(-DGXXGXGK-)和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(-DRH-)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明DPVTK基因與MDV、ILTV、HVT等禽類(lèi)皰疹病毒的進(jìn)化關(guān)系最近，與其他皰疹病毒關(guān)系則較遠(yuǎn)。 2.DPVTK基因原核表達(dá)及其多克隆抗體制備對(duì)擴(kuò)增的TK基因進(jìn)行pMD18-T載體克隆，通過(guò)對(duì)pMD18-T-TK及pET-32a(+)進(jìn)行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切、連接，將TK基因定向插入pET-32a(+)，經(jīng)

3、BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-TK，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以融合表達(dá)的包涵體形式存在，大小為58Ku左右。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳表達(dá)條件為IPTG0.6mmol/L，誘導(dǎo)4h。 利用重組表達(dá)蛋白所帶的6×His標(biāo)簽用鎳柱親和層析方法對(duì)其進(jìn)行純化，獲得較高純度的重組蛋白。過(guò)柱純化蛋白對(duì)家兔進(jìn)行免疫，制備兔高免血清，Western-Bl

4、otting檢測(cè)顯示，與重組表達(dá)蛋白特異性結(jié)合；ELISA效價(jià)高達(dá)1:512000。 3.間接免疫組化和間接免疫熒光法檢測(cè)DPVTK基因表達(dá)產(chǎn)物方法的建立及其在人工感染鴨體內(nèi)表達(dá)定位對(duì)制備兔抗DPVTK高免血清，采用High-Q陰離子柱層析純化得到兔抗DPVTKIgG，建立間接免疫過(guò)氧化物酶組織化學(xué)染色法(IISM)和間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)石蠟切片中DPV的方法；利用建立的IISM和IFA對(duì)28日齡鴨人工感染DPV死亡鴨不