刺參腐皮綜合癥相關microRNA調控機制初探.pdf

1、腐皮綜合癥是刺參（Apostichopus japonicus）養(yǎng)殖中最常見的疾病之一，已成為制約刺參養(yǎng)殖行業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的主要限制因素。目前，多種病原已在不同地區(qū)發(fā)病刺參中被分離獲得，但對于不同病原感染刺參過程中的腐皮綜合癥發(fā)生機制的研究卻知之甚少。microRNA（miRNA）是一類內源性的具有調控功能的非編碼小 RNA，能夠在轉錄后水平上抑制 mRNA翻譯或誘導 mRNA降解，從而在免疫反應調控中發(fā)揮重要作用，是研究宿主與病原互作的重

2、要調節(jié)因子。
　　本文立足于刺參腐皮綜合癥關鍵調控 miRNA分子，應用高通量的RNA-seq手段與iTRAQ蛋白質組技術，篩選其靶基因，同時應用生物信息學分析與雙熒光素酶報告系統(tǒng)，驗證 miRNA與其靶基因具有調控關系，以腐皮綜合癥病原之一燦爛弧菌（Vibrio splendidus）作為模擬病原，在細胞及個體水平上對miRNAs在宿主與病原互作中進行功能解析，以期為刺參腐皮綜合癥的分子治療提供理論基礎。研究成果如下：
　

3、　（1）構建了腐皮綜合癥發(fā)生前后刺參體腔細胞的均一化 cDNA文庫和數(shù)字表達基因文庫，高通量測序和生物信息學分析獲得了4,858個差異表達基因，其中上調表達基因2,163個，下調表達基因2,695個。從中識別了包括 miR-2008、miR-137以及miR-92a等在內的miRNA的靶基因；
　?。?）發(fā)展了雜交PCR篩選miR-92a靶基因的新體系，成功注釋了miR-92a的潛在靶基因10個，結合RNA-seq獲得的23個mi

4、R-92a靶基因，從中發(fā)現(xiàn)了SMURF、MEGF和PCBP等三個共同靶基因。探究了在燦爛弧菌以及LPS脅迫下，刺參miR-92a及其預測靶基因的的體內和體外表達模式變化，進一步確認了MEGF及SMURF作為miR-92a的靶基因的可能性。
　　（3）完成了iTRAQ基礎上的病原燦爛弧菌感染刺參過程中的體腔細胞全蛋白組的定量分析，成功注釋了相關表達蛋白2,049個（FDR<1.0％），篩選出差異表達蛋白228個，其中129個蛋白下調

5、表達，融合轉錄組數(shù)據(jù)，識別了miR-2008靶蛋白8個，miR-137的靶蛋白9個；
　?。?）建立了刺參個體和體外培養(yǎng)細胞兩個層次上的miRNA和靶基因功能鑒定體系，系統(tǒng)闡明了刺參 miR-137和miR-2008分化靶向甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶（BHMT）介導細胞 ROS產(chǎn)生抵御病原微生物感染的新機制。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定了BHMT3’UTR中miR-137和miR-2008各具一個功能結合位點。結合定量PCR與Wes