抗甲胺磷噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、篩選及單鏈抗體的表達(dá)與特性研究.pdf

1、甲胺磷(O，S-二甲基硫代磷酰胺)是一種劇毒的有機(jī)磷類農(nóng)藥，由于較好的殺蟲(chóng)效果往往被違禁使用，危害嚴(yán)重，有必要進(jìn)一步對(duì)其加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。免疫分析法具有靈敏、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有突出的優(yōu)勢(shì)。目前雖有制備甲胺磷多克隆抗體和單克隆抗體的報(bào)道，但其抗體制備需進(jìn)行動(dòng)物免疫及昂貴的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，周期長(zhǎng)，成本高.第三代抗體一重組抗體的出現(xiàn)為快速、低成本制備小分子化學(xué)農(nóng)藥抗體提供了新的途徑。為此，本論文開(kāi)展了抗甲胺磷噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、

2、篩選及抗甲胺磷單鏈抗體的表達(dá)與特性研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1、Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析 利用活潑酯法將合成的甲胺磷半抗原β-(O，S-二甲基磷酰)氨基丙酸(HM3)與牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)分別制備免疫原HM3-BSA和包被原HM3-OVA。將HM3-BSA按高(H)、中(M)、低(1)3個(gè)不同劑量組分別免疫Balb/c小鼠。抗血清分析結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)8次近6個(gè)月時(shí)間的免疫

3、在高(H)劑量組中獲得了1只良好免疫效果的H3號(hào)Balb/c小鼠。 2、抗體可變區(qū)基因的獲得及抗甲胺磷噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建 取H3號(hào)Balb/c免疫小鼠的脾細(xì)胞提取信使RNA(mRNA)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增出了大小約340bp和320bp的抗體重(VH)、輕鏈(VL)可變區(qū)基因片段。純化回收的VH與VL基因在接近等摩爾濃度下，首先采用含有Linker接頭片段的引物利用重疊延伸拼接法(SOE-PCR)將

4、VH與VL基因片段組裝成單鏈抗體(ScFv)基因片段，再用帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物(5’端SfiI，3’端NotI)擴(kuò)增含內(nèi)切酶位點(diǎn)的ScFv基因，獲得了大小約750bp的目的片段，純化回收并分別用SfiI和NotI酶切消化后，與經(jīng)SfiI、NotI雙酶切過(guò)的噬菌粒載體pCANTAB5E連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTG1，建成了庫(kù)容約9.8×105的抗甲胺磷噬菌體單鏈抗體庫(kù)。經(jīng)對(duì)隨機(jī)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的PCR及HindIII.EcoRI雙

5、酶切鑒定，該抗體庫(kù)重組率高。BstNI酶切圖譜顯示該噬菌體單鏈抗體庫(kù)具有良好的多樣性。 3、抗甲胺磷噬菌體單鏈抗體庫(kù)的篩選和鑒定 借助輔助噬菌體M13KO7的超感染，擴(kuò)建了滴度約1.75×1013pfu/mL的抗甲胺磷噬菌體-ScFv表面展示文庫(kù)，通過(guò)降低抗原包被濃度和增強(qiáng)洗脫力度的方法，以包被原HM3-OVA對(duì)展示庫(kù)進(jìn)行了五輪“吸附、洗脫、擴(kuò)增”的富集篩選，結(jié)果顯示，從第三輪開(kāi)始，噬菌體回收率、多克隆噬菌體ELISA的

6、OD值及陽(yáng)性率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。從第5輪篩選后得到的細(xì)菌集落中分批隨機(jī)挑選大量單克隆，經(jīng)單克隆噬菌體ELISA及競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)一步篩選鑒定，獲得了6個(gè)特異性較強(qiáng)的抗甲胺磷噬菌體單鏈抗體陽(yáng)性克隆，基因序列分析及Blast數(shù)據(jù)庫(kù)檢索表明所得6個(gè)陽(yáng)性克隆的序列互不相同，均符合鼠源單鏈可變區(qū)抗體基因的結(jié)構(gòu)和特征。 4、抗甲胺磷單鏈抗體在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及性質(zhì)鑒定 將6個(gè)甲胺磷噬菌體陽(yáng)性克隆提取噬菌粒分別轉(zhuǎn)化琥珀終止非抑制型

7、大腸桿菌E.coliHB2151，IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜小量制備各克隆的可溶性單鏈抗體.收集細(xì)菌沉淀及培養(yǎng)上清，采用滲透休克法提取菌體細(xì)胞周質(zhì)中的可溶性單鏈抗體，并對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾濃縮。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示，周質(zhì)腔提取物及濃縮上清在分子量約30KD處明顯出現(xiàn)一增粗條帶，與單鏈抗體的預(yù)期分子量相符，而陰性對(duì)照菌中沒(méi)有該條帶.間接ELISA結(jié)果顯示，6個(gè)克隆的細(xì)菌培養(yǎng)上清和周質(zhì)腔提取物中的抗體均能與包被抗原反應(yīng)，

8、說(shuō)明分泌型單鏈抗體得到了正確的折疊和表達(dá)。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA初步分析6個(gè)克隆新鮮制備的周質(zhì)腔提取物對(duì)游離甲胺磷的競(jìng)爭(zhēng)抑制性，結(jié)果顯示，6個(gè)克隆的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)游離甲胺磷均具有不同程度的抑制作用，其中克隆Met-93的周質(zhì)腔提取物抑制中濃度I50值最高(887.66μg/mL)，克隆Met-28D4的周質(zhì)腔提取物I50值最低(146.74μg/mL). 以抗體表達(dá)的最優(yōu)化條件對(duì)Met-28D4陽(yáng)性克隆株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(1L)大量制備純化

9、單鏈抗體，抗體產(chǎn)量約0.98mg/L培養(yǎng)基.以純化單鏈抗體為免疫試劑，初步建立了甲胺磷競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析法，該ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1～500μg/mL，I50為118.69μg/mL，檢出限I20為3.36μg/mL；在該線性范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.3％和4.8％，稻谷和小白菜樣品中添加甲胺磷后的平均回收率分別為83.8％和87.0％。交叉反應(yīng)結(jié)果顯示，本研究制備的純化Met-28D4單鏈抗體僅與乙酰甲胺

10、磷有部分交叉反應(yīng)(4.9％)，而與供試的其它5種有機(jī)磷農(nóng)藥(敵敵畏、樂(lè)果、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷和水胺硫磷)的交叉反應(yīng)率均小于0.1％，表明所制備的純化單鏈抗體對(duì)甲胺磷的識(shí)別是高度特異的，抗體穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，在蛋白保護(hù)劑存在條件下，4℃保存下的純化單鏈抗體其結(jié)合活性可維持約6-7周的時(shí)間，基本能滿足短期內(nèi)單鏈抗體研究的需要，但在大規(guī)模生產(chǎn)、應(yīng)用等方面，就顯得穩(wěn)定性不夠。 5、抗甲胺磷單鏈抗體在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)及性質(zhì)鑒定

11、 在巴斯德畢赤酵母p.pastoris(X-33)中分泌表達(dá)Met-28D4-ScFv。設(shè)計(jì)引物從Met-28D4-pCANTAB5E-ScFv上擴(kuò)增Met-28D4-ScFv，亞克隆至p.pastoris表達(dá)載體pPICZaC，獲得酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaC-ScFv.表達(dá)質(zhì)粒pPICZaC-ScFv線形化后，電轉(zhuǎn)化p.pastoris(X-33)。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子的酵母染色體中均整合有外源ScF

12、v基因。在抗性梯度篩選多拷貝整合菌株試驗(yàn)中，共獲得5個(gè)在2000μg/mLZeocinTM的YPDS選擇平板上正常生長(zhǎng)的菌落，表型鑒定結(jié)果均為甲醇利用快速型(Mut+)。對(duì)5個(gè)多拷貝Mut+型轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，各菌株誘導(dǎo)48h后在約30KD處均可見(jiàn)明顯條帶，72h處表達(dá)量最大，各菌株表達(dá)量之間無(wú)明顯差異；間接ELISA結(jié)果顯示，各菌株誘導(dǎo)72h的表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原結(jié)合活性。 選其中一個(gè)穩(wěn)定高表

13、達(dá)的X-33-Pp-Met-28D4-1菌株進(jìn)行優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，優(yōu)化后的條件為：本實(shí)驗(yàn)室30℃、250rpm的振蕩培養(yǎng)條件下，菌體接種量OD600nm=1.5，培養(yǎng)基pH值6.5，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度1.0％，誘導(dǎo)時(shí)間72h.經(jīng)過(guò)優(yōu)化條件下的誘導(dǎo)表達(dá)，單鏈抗體的表達(dá)量達(dá)25mg/L，比Invitrogen公司推薦的誘導(dǎo)表達(dá)條件下的表達(dá)量高5mg/L.對(duì)優(yōu)化條件下的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA初步試驗(yàn)，結(jié)果表明，酵母表達(dá)

14、純化抗甲胺磷單鏈抗體與游離甲胺磷具有較好的抗原結(jié)合特異性，其I50為93.52μg/mL，與大腸桿菌表達(dá)的單鏈抗體的性質(zhì)基本接近；交叉反應(yīng)結(jié)果顯示，酵母表達(dá)純化單鏈抗體與乙酰甲胺磷的交叉反應(yīng)率為3.8％，與其它農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均小于0.1％。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，酵母表達(dá)純化抗甲胺磷單鏈抗體的穩(wěn)定性比大腸桿菌表達(dá)的單鏈抗體的穩(wěn)定性有了一定的提高。 本論文研究結(jié)果為甲胺磷特異性抗體的大量制備奠定了一定的基礎(chǔ)，對(duì)開(kāi)發(fā)其它小分子化學(xué)農(nóng)藥的重