狗牙根脫水素基因的表達(dá)分析及其啟動(dòng)子克隆.pdf

1、狗牙根（Cynodon dactylon L.）屬多年生禾本科植物，是應(yīng)用廣泛的暖季型草坪草。干旱是限制其應(yīng)用的主要環(huán)境因子。水分脅迫可以誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，其中脫水素基因（dehydrin gene，DHN）在植物處于干旱、脫水時(shí)大量積累并對(duì)多種環(huán)境脅迫和ABA激素均有響應(yīng)。脫水素屬于LEA-II（late embryogenesis abundant proteins-II）家族蛋白，是植物逆境中表達(dá)的一種響應(yīng)蛋白。
　　本研究

2、以狗牙根品種‘Tifway’（耐旱型）和‘C299’（干旱敏感型）為材料，研究脫水素基因CdDHN4在多種逆境、不同組織及不同激素處理下的表達(dá)特征。同時(shí)以狗牙根基因組為模板，通過基因步移方法克隆CdDHN45’端上游啟動(dòng)子序列，并在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，分析該啟動(dòng)子的功能及調(diào)控方式。對(duì)CdDHN4基因啟動(dòng)子序列、表達(dá)調(diào)控以及對(duì)逆境脅迫下響應(yīng)特征的研究，可為狗牙根脫水素基因抗逆機(jī)理機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　1、以‘T

3、ifway’為材料，設(shè)置高溫(45℃/40℃)、低溫(10℃/5℃)、干旱、鹽(200mM NaCl)和對(duì)照五個(gè)處理，研究四種環(huán)境脅迫對(duì)‘Tifway’CdDHN4的表達(dá)影響。結(jié)果表明，四種脅迫均使‘Tifway’產(chǎn)生生理傷害，導(dǎo)致脫水素基因表達(dá)量顯著增加；長(zhǎng)期脅迫(15d)，四種處理對(duì)狗牙根傷害程度依次為干旱>高鹽(200mM NaCl)>低溫(10℃/5℃)>高溫(45℃/40℃)，CdDHN4的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，表明脫水素基

4、因的表達(dá)可能與植物抗逆性存在相關(guān)關(guān)系。
　　2、以‘Tifway’和‘C299’為材料，分析干旱脅迫0d,5d,10d,15d下植物根、莖、葉中CdDHN4的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，對(duì)于耐旱型品種和干旱敏感型品種，干旱處理都能夠誘導(dǎo)脫水素基因表達(dá)。處理15d時(shí)，‘Tifway’莖和葉中脫水素基因 CdDHN4的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于‘C299’，認(rèn)為脫水素的積累與植物抗逆性密切相關(guān)，研究結(jié)果進(jìn)一步證明了脫水素基因是干旱應(yīng)答基因。

5、　　3、以‘Tifway’和‘C299’為材料，研究不同濃度的植物激素IAA、ABA和GA噴施處理下兩品種中CdDHN4的表達(dá)差異及表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，三種激素均可誘導(dǎo)脫水素基因的表達(dá)。濃度為5μM和50μM的ABA處理6h，12h時(shí)，耐旱型植物中的表達(dá)量顯著高于干旱敏感型中的表達(dá)量。
　　4、根據(jù)已獲得的狗牙根脫水素基因CdDHN4的基因組DNA編碼框全長(zhǎng)序列，通過基因步移方法克隆其5’-端上游啟動(dòng)子序列，并對(duì)獲得的啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)

6、測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)共獲得CdDHN4基因啟動(dòng)子1242bp，命名為 CdDHN4-P，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有作為啟動(dòng)子的典型元件，如轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA-box和CAAT-box等；還含有許多與逆境相關(guān)的順式作用元件，如ABRE(ABA響應(yīng)元件)、TGACG-motif(茉莉酸甲酯類響應(yīng)元件)、TATC-box(GA響應(yīng)元件)、LTRE(低溫響應(yīng)元件)、光應(yīng)答元件GT1-motif和ACE等。
　　5、對(duì)CdDHN4-P進(jìn)行瞬