攜帶超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建與潛在的靶向灌注抗膀胱腫瘤作用.pdf

1、目的：溶瘤病毒（oncolytic viruse）是指能特異性感染腫瘤細胞并在腫瘤細胞中大量復(fù)制最終裂解腫瘤細胞，能作為載體將目的基因?qū)肽[瘤細胞內(nèi)。超抗原（Superantigen，SAg）是一組細菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子，其抗腫瘤作用主要是由SAg依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（Supera antigen-dependented cellulartoxicity，SDCC）來完成。本實驗通過重組pSG218質(zhì)粒構(gòu)建攜帶超抗原葡萄球菌腸

2、毒素A（SEA）基因的DC318-SEA溶瘤腺病毒載體，加以鑒定，并將其擴增純化，以便構(gòu)建出具有潛在抗膀胱腫瘤作用的溶瘤腺病毒。
　　 方法：1.攜帶超抗原SEA基因的重組質(zhì)粒pDC318-SEA的構(gòu)建、鑒定：將溶瘤腺病毒載體pSG218和超抗原SEA基因PCR擴增片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和SalⅠ雙酶切后，12℃連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板（含AMP）后，37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～12

3、 h。挑取生長的細菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB溶液中，37℃搖床擴增12 h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定及PCR鑒定正確后命名為pDC318-SEA。
　　 2.溶瘤腺病毒DC318-SEA的重組及鑒定：將質(zhì)粒pDC318-SEA與病毒骨架質(zhì)粒pPE3-ccdB共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，在其內(nèi)同源重組，9～14d出現(xiàn)病毒空斑，應(yīng)用QIAampDNABlood Mini Kit提取腺病毒DNA，應(yīng)用PCR進行鑒定。經(jīng)鑒定正

4、確的重組腺病毒命名為DC318-SEA。
　　 3.重組溶瘤腺病毒的擴增、純化和滴度測定：首次擴增的病毒保存液加入HEK293細胞培養(yǎng)72 h，收集細胞反復(fù)凍融離心3次，收集上清反復(fù)擴增至需要病毒量。用氯化銫密度梯度超速離心法純化，用空斑實驗法測定病毒滴度。
　　 結(jié)果：1.攜帶超抗原SEA基因的重組質(zhì)粒pDC318-SEA的鑒定：用SEA引物擴增pDC318-SEA載體，可以看到大小為774 bp的SEA基因片段；Sp

5、eⅠ+SalⅠ和ClaⅠ+HincⅡ?qū)DC318-SEA進行雙酶切后，可以看到768 bp的SEA基因片段+3888 bp大小的pSG218質(zhì)粒片段和大小為2325bp+1995bp+354bp大小片段，表明pDC318-SEA中已含有SEA基因片段。
　　 2.攜帶超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒DC318-SEA的PCR鑒定：提取病毒DNA，用SEA引物做PCR鑒定，擴增出774 bp片段，說明DC318-SEA可以表達SEA