可注射性納米羥基磷灰石、殼聚糖復(fù)合材料與骨髓基質(zhì)細胞生物相容性及其修復(fù)骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 各種因為(創(chuàng)傷,腫瘤、感染等)引起的骨缺損修復(fù)一直是骨科的一大難題。目前主要的治療方法有自體骨移植、異體骨移植。它們都有各自的缺點:自體骨移植的缺點有來源有限、供體部位易發(fā)生感染、畸形以及植骨功能的繼發(fā)喪失等；異體骨移植有傳播疾病、引起宿主免疫排斥反應(yīng)等的危險。組織工程的興起為骨缺損的修復(fù)提供了一條廣闊的途徑,尋找一種合適的骨缺損修復(fù)材料是近年來骨組織工程的研究熱點。理想的骨組織工程材料要求具備以下幾點:良好的

2、生物相容性及降解性；骨傳導(dǎo)性及誘導(dǎo)性；滿意的機械強度；可塑形性；合適的孔徑,保證新生骨組織的長入和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸供應(yīng)；支持骨細胞生長和功能分化的表面化學(xué)性質(zhì)與微結(jié)構(gòu)。單一的生物材料往往很難具有如此多的特性,因而不同材料之間復(fù)合越來越受到大家的關(guān)注,清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系采用仿生學(xué)原理,制成一種可注射的塑形簡便并且具有良好骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)性的納米羥基磷灰石/殼聚糖(nano-Hydroxyapatite/chitosan,nHA/CS)復(fù)

3、合骨修復(fù)材料,孔隙率90％,孔徑50-200μm。該材料具有較好的初始穩(wěn)定性和強度,既可以原位成形固化,滿足有支撐需要的骨缺損部位的修復(fù),又可以任意塑形,對其他類型骨缺損部位進行原位填充。但該復(fù)合材料是否具良好的生物相容性,對機體細胞是否無害尚不確切,同時該材料對骨缺損的修復(fù)效果也待進一步動物實驗證實。
　　 研究目的:
　　 1、采用密度梯度離心法獲得原代骨髓基質(zhì)細胞(Bone Marrow Stem Cells,BM

4、SCs),體外將穩(wěn)定的傳至第3代的兔骨髓基質(zhì)細胞與可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料共同培養(yǎng),觀察該材料的生物相容性。
　　 2、建立兔股骨髁上骨缺損模型,將可注射性羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料植入兔股骨髁上骨缺損內(nèi),觀察該材料對骨缺損的修復(fù)效果。
　　 時間及地點:本實驗于2008-08至2009-11在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院中心實驗室完成。
　　 研究方法:
　　 1、納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料生

5、物相容性實驗方法:
　　 采用廣泛認(rèn)可的密度梯度離心法從2周齡健康新西蘭大白兔股骨和脛骨骨髓中獲取原代兔骨髓基質(zhì)細胞,將穩(wěn)定的傳至第三代的兔骨髓基質(zhì)細胞接種到納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料上,體外復(fù)合培養(yǎng),作為實驗組,單純骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)作為對照組。倒置相差顯微鏡、電鏡對接種到材料上的細胞進行形態(tài)學(xué)及生長增殖狀況進行觀察,計數(shù)細胞接種后1,2,4 h在材料表面的黏附狀況,并計算黏附率,流式細胞儀檢測種植細胞的細胞周期,有無異倍體

6、出現(xiàn),并計算增殖指數(shù),對接種細胞的遺傳學(xué)行為進行評價。
　　 2、納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料骨缺損修復(fù)實驗方法:
　　 將24只體重為1.5-2.0kg的新西蘭白兔,雙側(cè)股骨髁上建立直徑為7mm,深度為10mm骨缺損,并隨機分為4周組、8周組、12周組,每組8只。將可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料植入一側(cè)骨缺損作為實驗組,另一側(cè)植入單純可注射殼聚糖材料作為對照組。分別于4、8、12周末①大體觀察材料植入后動物的

7、生命活動狀況,并觀察標(biāo)本骨缺損修復(fù)愈合狀況；②X線、CT橫斷面掃描進一步觀察骨缺損的影像學(xué)修復(fù)效果,并根據(jù)CT值,對骨缺損愈合狀況進行評估；③組織病理學(xué)切片觀察骨缺損與材料交界部位新生骨形成,材料降解,骨缺損愈合的病理變化過程,④電鏡檢測納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料側(cè)骨缺損部位植入材料與自體骨結(jié)合狀況及新骨形成,材料降解的連續(xù)過程。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料生物相容性實驗結(jié)果:

8、　　 ①倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),梭形的骨髓基質(zhì)細胞圍繞在納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料邊緣生長,隨著時間的遞增,細胞數(shù)目逐漸增加,生長狀況良好。
　　 ②電鏡學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細胞在納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料表面上生長狀況良好,從胞體伸出長短不等的偽足黏附材料上。
　　 ③黏附率測定結(jié)果表明,細胞接種到納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料l h時黏附率低于對照組(P<0.05),但接種2,4 h后兩組黏附率差異無顯著性意義(

9、P>0.05)。
　　 ④流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞接種后,兩組均保持正常的分裂增殖速度(P>0.05)。材料組和對照組細胞皆為正常的二倍體細胞,未見異倍體細胞形成,納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料對兔骨髓基質(zhì)細胞的細胞周期影響不大。
　　 2、納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料骨缺損修復(fù)實驗:
　　 ①大體觀察:術(shù)后所有兔子生命活動狀況均未見異常,觀察期間內(nèi)未出現(xiàn)肢體骨折現(xiàn)象。
　　 實驗組:4周后正常骨組織與材

10、料之間的界限尚清晰；術(shù)后8周股骨髁上缺損區(qū)材料與周圍宿主骨組織界限模糊,表面光滑,有光澤,按壓移植部位有阻抗；術(shù)后12周骨缺損完全修復(fù),色澤與周圍無明顯差異,按壓移植部位阻抗與周邊正常骨組織相似,高度約與正常骨組織相平。
　　 對照組:對照組4周后材料和骨組織結(jié)合較為緊密,無明顯縫隙,纖維軟組織長入材料中；術(shù)后8周材料與骨組織界限模糊,表面有光澤但欠光滑,顏色稍暗,按壓移植部位稍有阻抗；術(shù)后12周骨缺損未完全愈合,色澤與周圍無明

11、顯差異,按壓移植部位有一定的阻抗,有部分骨皮質(zhì)缺損,纖維組織填充。
　　 ②X線檢查結(jié)果:
　　 實驗組:4周時正常骨組織與材料之間存在一環(huán)形的透光帶,髁上缺損可見:8周時正常骨組織與材料之間透光帶模糊,缺損區(qū)域透光性稍低于周圍宿主骨組織；12周時髁上骨缺損愈合,未見與周圍骨組織有明顯的透光性差異。
　　 對照組:4周時股骨髁上骨缺損清晰可見,材料與周圍組織之間存在透光帶；8周時骨缺損較前減小,缺損區(qū)域透光性低于

12、周圍宿主骨組織；12周時骨缺損較前進一減小,但未完全愈合。
　　 ③CT檢查:
　　 實驗組:4周正常骨組織與材料之間有明確的界限,骨缺損外層骨皮質(zhì)不連續(xù)；8周時正常骨組織與材料界限模糊,外層骨皮質(zhì)已有連接；12周時骨缺損完全修復(fù),缺損區(qū)域于周圍骨組織之間未見有明顯差異。
　　 對照組:4周正常骨組織與材料之間界限明顯,并可見到缺損；8周時界限稍模糊,骨缺損較前有愈合,但外層骨皮質(zhì)不連續(xù)；12周時骨缺損部分修復(fù),

13、仍有少部分骨皮質(zhì)仍不連續(xù)。
　　 CT值比較提示4、8、12周末實驗組、對照組骨修復(fù)效果均存在差異(P<0.05),結(jié)合大體及影像學(xué)證據(jù),實驗組骨修復(fù)效果優(yōu)于對照組。
　　 ④組織形態(tài)學(xué):
　　 實驗組:4周時,材料與宿主骨交界有新骨形成,大量纖維骨痂形成,材料與骨組織生物形容性好,可見大量成骨細胞生長,此時已有部分材料降解；8周后,出現(xiàn)大量新生骨小梁,且骨小梁排列較整齊,并可見少量板層狀樣骨組織,材料較前有進一

14、步降解；12周時,材料已完全降解,可見大量新生板層骨組織,哈佛氏系統(tǒng)形成,原缺損區(qū)被新生板層骨組織填充,骨組織相互連續(xù)。
　　 對照組:4周時纖維軟組織長入材料,并可見淋巴細胞等,宿主骨邊緣可見少量纖維骨痂形成,并見材料降解；8周后見大量纖維骨痂形成,少量新生骨小梁形成,未見板層骨形成,材料較前進一步降解；12周后少量板層樣骨組織形成,纖維組織填充原骨缺損區(qū)域,材料已完全降解。
　　 ⑤電鏡學(xué)觀察
　　 電鏡檢查