銅綠假單胞菌噬菌體PaP3早期蛋白的鑒定及其與宿主菌的相互作用的研究-.pdf

1、銅綠假單胞菌是嚴重燒傷、創(chuàng)傷、囊性纖維病變及晚期腫瘤患者死亡的重要原因，嚴重危害著人類的健康。而銅綠假單胞菌感染的治療一直比較棘手，因該菌可通過多種途徑對許多常用抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥性，如產(chǎn)生碳青霉烯類酶、改變抗菌藥物作用的靶位、丟失外膜孔蛋白、表達多種藥主動外排系統(tǒng)及形成生物膜等。而現(xiàn)有抗生素的作用范圍主要是針對細菌細胞壁、DNA和蛋白質(zhì)的生物合成過程中的某一個關(guān)鍵分子，如針對DNA合成的靶點只有DNA拓撲異構(gòu)酶。[1]因此，迫切需要

2、尋找抗銅綠假單胞菌藥物作用的新靶點，以篩選新型抗生素更好地解決現(xiàn)有細菌的耐藥性問題。于是，我們把目光投向了細菌在自然界中的天敵--噬菌體。
　　 噬菌體是細菌的病毒，是一種非細胞結(jié)構(gòu)的生命體，因此它進入宿主菌后必須利用宿主菌大分子合成機制和能量裝置進行自身的復(fù)制，這是一個非常復(fù)雜的過程，涉及了眾多的調(diào)控機制。在漫長的進化歷程中，噬菌體發(fā)展出一套獨特的機制來限制宿主菌的生長與繁殖，即噬菌體基因組編碼產(chǎn)生某些特殊的蛋白分子，可與宿主

3、菌生長、代謝的重要調(diào)控性蛋白結(jié)合，并使其鈍化，從而阻斷宿主的生長與繁殖，將宿主菌大分子合成機制和能量裝置轉(zhuǎn)向噬菌體自身的復(fù)制與增值，這就是所謂的“關(guān)閉宿主”功能(shut-off functions)[2]。
　　 目前研究表明，噬菌體編碼的蛋白與宿主蛋白間的相互作用在“關(guān)閉宿主”功能方面發(fā)揮了十分重要的作用，主要涉及噬菌體編碼的某些蛋白分子與宿主菌的分裂、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)因子的相互作用。到目前為止，對已經(jīng)完成測序的6

4、00多種噬菌體基因組序列分析表明，很大一部分預(yù)測的ORFs與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列無相似性；即使是人們研究最多的T4噬菌體，也有超過一半的ORF功能沒有明確?？梢姡覀兯莆盏幕蚪M數(shù)據(jù)顯示絕大部分噬菌體與宿主間的相互作用還不被人們所了解。而在而在噬菌體對宿主菌的整個感染過程中，噬菌體的早期基因表達至關(guān)重要，決定著整個感染周期的進展。因此本課題擬充分利用銅綠假單胞菌噬菌體基因組資源，通過二維電泳-質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)和基因芯片鑒定噬菌

5、體早期蛋白表達以及相應(yīng)的宿主基因表達的變化，進一步初步鑒定出與噬菌體早期蛋白相互作用的宿主菌蛋白。本課題的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3感染宿主菌PA3后蛋白質(zhì)譜的表達變化：利用二維電泳-質(zhì)譜技術(shù)分別在PaP3感染宿主后5min，10min，20min，30min，80min，120min，200min幾個時間點檢測PaP3與宿主所產(chǎn)生的差異表達蛋白。經(jīng)過重復(fù)實驗與歸類分析，我們初步鑒定出22個宿主被抑

6、制蛋白(主要包括核糖體蛋白、翻譯延伸因子、鞭毛相關(guān)蛋白及分子伴侶)，15個宿主被誘導(dǎo)蛋白(主要涉及能量合成、糖、脂代謝及轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白質(zhì))及12個噬菌體自身表達蛋白(主要為結(jié)構(gòu)蛋白及未知功能蛋白)。
　　 2.PaP3全基因組在感染宿主菌PA3過程中的分時期表達：利用基因芯片檢測噬菌體PaP3在感染宿主菌PA3后不同時間其全基因組在轉(zhuǎn)錄水平的表達譜變化，并進行非監(jiān)督層次聚類(hierarchical clustering)分析。利

7、用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素(Cm)和DNA復(fù)制抑制劑磷酸乙酸(PAA)實驗確定PaP3全基因組的分時期表達情況。結(jié)果表明，根據(jù)時間表達模式的不同，PaP3全基因組可分為三大類：15個早期基因(ORF71-57)、35個中期基因(ORF56-22)及21個晚期基因(ORF21-1)。在PaP3基因組結(jié)構(gòu)中，這三類基因各自串聯(lián)分布且可能受不同的操縱子調(diào)控。
　　 3.PaP3感染后宿主菌PA3的基因表達變化：利用基因芯片技術(shù)考察了PA

8、3被PaP3感染后5min全基因組表達的變化，通過SAM分析、主成份分析、相關(guān)性分析、GoTermPie Picture分析、及差異基因的功能分類等分析，結(jié)果顯示PA3的部分未知功能基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達水平在被PaP3感染后顯著下調(diào)，提示噬菌體感染早期可能對宿主菌的基因表達進行全局性調(diào)控，其中可能涉及噬菌體早期編碼基因產(chǎn)物與宿主的相互作用。
　　 4.根據(jù)蛋白質(zhì)譜及基因表達譜分析選擇若干噬菌體早期蛋白(ORF66-71)，構(gòu)

9、建細菌雙雜交誘餌質(zhì)粒，利用細菌雙雜交技術(shù)篩選PA3基因組表達文庫質(zhì)粒，鑒定出可與噬菌體早期蛋白ORF66、ORF70相互作用的宿主菌蛋白124-PA2426、133-PA3351及133-PA3622。
　　 綜上所述，通過蛋白質(zhì)譜及全基因組表達譜分析，我們對噬菌體感染宿主有了一個較為宏觀的認識，初步確定PaP3感染過程中其早期、中期及晚期基因隨時間有序表達，且宿主菌的基因表達在噬菌體感染早期即受到全局性調(diào)控；并從宏觀落實到微觀