家蠶核型多角體病毒基因p24的功能研究.pdf

1、P24是一種重要的核衣殼相關(guān)蛋白，其基因p24在桿狀病毒生活史中所發(fā)揮的作用以及在細(xì)胞中的功能少有人研究，本實(shí)驗(yàn)選取BmNPV為載體對該基因進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)首先擴(kuò)增出含有Bmp24基因同源臂的打靶片段，利用Red重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了打靶片段與目的基因之間的替換，進(jìn)而成功構(gòu)建了Bmp24缺失型病毒并命名為Bmp24-ko-Bacmid;然后構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pF astBacHTB-p24，利用Bac-to-Bac系統(tǒng)將該Bmp24定點(diǎn)補(bǔ)回到

2、缺失型Bacmid的多角體啟動(dòng)子下游，成功構(gòu)建了Bmp24補(bǔ)回型Bacmid并命名為Bmp24-re-Bacmid。
　　為了研究Bmp24在細(xì)胞中的調(diào)控功能，實(shí)驗(yàn)將缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)、補(bǔ)回型病毒(Bmp24-re-Bacmid)以及野生型病毒(wtBacmid)等量轉(zhuǎn)染到正常的家蠶卵巢細(xì)胞(BmN)當(dāng)中。病毒滴度測定結(jié)果顯示3種病毒的轉(zhuǎn)染都能夠引起細(xì)胞發(fā)病，即都可以產(chǎn)生有感染力的子代病毒。通過滴度值得比

3、較，發(fā)現(xiàn)Bmp24缺失型病毒的滴度值顯著低于野生型和補(bǔ)回型病毒（P＜0.05）。為了進(jìn)一步了解Bmp24對病毒顆粒包裝的影響，收集感染48h后的細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡分析，電鏡結(jié)果顯示Bmp24缺失型病毒感染的細(xì)胞中只有少量細(xì)長的桿狀結(jié)構(gòu)，但在野生型病毒感染的細(xì)胞當(dāng)中出現(xiàn)大量包裝成熟的病毒顆粒。透射電鏡顯示缺失Bmp24仍然可以包裝子代病毒，但對包裝為成熟的病毒粒子有顯著影響，與滴度測定結(jié)果一致。
　　為了研究Bmp24的缺失對病毒基因

4、組復(fù)制的影響，實(shí)驗(yàn)選取了ODV的囊膜蛋白結(jié)構(gòu)基因Bmgp41為代表基因，進(jìn)行qPCR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著3種病毒基因組轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，Bmgp41的拷貝數(shù)均增加，但各時(shí)相Bmgp41的拷貝數(shù)無顯著差異。為了研究Bmp24的缺失對病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平的影響，實(shí)驗(yàn)選取了BmNPV中非常具有代表性的3個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR，分別是病毒早期基因Bmlef-3、晚期基因Bmvp39和極晚期基因Bmp10。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于野生型

5、病毒，Bmp24的缺失會(huì)顯著降低子代病毒基因組中Bmlef-3、Bmvp39和Bmp10的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），但Bmp24的補(bǔ)回可以彌補(bǔ)這一現(xiàn)象。綜上所述可知，Bmp24基因的缺失對子代病毒基因組的復(fù)制水平?jīng)]有顯著影響，即是病毒復(fù)制的非必需基因;缺失Bmp24基因的Bacmid仍然可以產(chǎn)生有感染力的BV粒子，說明Bmp24基因不是BV形成的必需基因;但Bmp24的缺失會(huì)降低子代病毒的感染力，說明Bmp24對BV的感染力有一定影響。

6、RT-qPCR結(jié)果說明Bmp24基因缺失會(huì)降低病毒基因組早期、晚期以及極晚期基因的轉(zhuǎn)錄水平，即Bmp24的缺失對病毒基因轉(zhuǎn)錄水平有一定影響。
　　為了進(jìn)一步研究該基因的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)將目的基因Bmp24克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)上，在大腸桿菌BL-21(star)中誘導(dǎo)表達(dá)帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白，大小約為24.8KDa，與預(yù)期一致。通過Ni柱純化獲得BmP24并進(jìn)行BCA定量，通過免疫新西蘭雄兔制備多克隆抗體。EL