豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(PCV)是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的的重要病原之一。分為兩個(gè)血清型PCV-1和PCV-2。由于PCV-2具有致病性，可以引起免疫抑制，誘發(fā)多種疾病，如豬皮炎綜合征、豬腎炎綜合征、繁殖和呼吸障礙以及仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征等。PCV-1和PCV-2存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，ORF1的同源性可達(dá)到86％，所以建立對(duì)PCV-2的鑒別診斷方法尤為重要。本研究通過(guò)利用PCV2重組Cap蛋白制備單克隆抗體建立ELISA來(lái)鑒別PCV-2。根據(jù)Genba

2、nk上發(fā)布的PCV-2的基因序列，利用Primer Primer5.0軟件進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增PCV-2 Cap基因，構(gòu)建質(zhì)粒PMD-19T-Cap，分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得目的基因片段，通過(guò)測(cè)序，證實(shí)了所擴(kuò)增條帶的準(zhǔn)確性。利用大腸桿菌BL21表達(dá)PCV-2 Cap蛋白，對(duì)重組蛋白表達(dá)參數(shù)、純化工藝及免疫活性進(jìn)行了研究。本研究中一系列搖瓶試驗(yàn)，分別進(jìn)行了培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)劑濃度的選擇、誘導(dǎo)起始時(shí)間的選擇、誘導(dǎo)時(shí)間的選擇

3、的研究。最適宜的搖瓶發(fā)酵條件為:LB培養(yǎng)基作為重組菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重組菌在37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后，以0.2mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)5個(gè)小時(shí)，可使目的蛋白的表達(dá)量最高，可達(dá)0.6～0.7mg/ml。
　　經(jīng)純化的PCV-2 Cap蛋白可以被PCV-2特異性抗體所識(shí)別，具有良好的免疫活性。重組PCV-2 Cap蛋白分別免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。優(yōu)化了單克隆抗體腹水的制備工藝，比較誘

4、導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑接種劑量、雜交瘤細(xì)胞接種量對(duì)腹水產(chǎn)量、蛋白含量、活性進(jìn)行測(cè)定。以弗氏佐劑作為誘導(dǎo)劑，小鼠腹腔接種0.5ml進(jìn)行預(yù)處理，每只接種106cell，產(chǎn)量較高，效價(jià)達(dá)1∶102400。
　　經(jīng)純化后的Cap蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)，電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，應(yīng)在27KDa處出現(xiàn)一條清晰的條帶，而無(wú)其它雜帶。染色后的凝膠經(jīng)凝膠成像儀掃描，純度應(yīng)不低于90％。將包被抗原原料在1∶1000稀釋時(shí)包被酶標(biāo)反應(yīng)板，按“用法與

5、判定”檢測(cè)陰性參考品6份(N1-N6)、陽(yáng)性參考品5份（P1-P5）、靈敏度參考品5份(S1-S5)，陰性參考品應(yīng)6/6陰性、陽(yáng)性參考品應(yīng)5/5陽(yáng)性、靈敏度參考品應(yīng)3/5陽(yáng)性。選擇最佳使用比例，檢測(cè)活性指標(biāo)。
　　按照優(yōu)化條件，制備了抗PCV2 Cap蛋白單克隆抗體腹水，使用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法結(jié)合陰離子交換層析法對(duì)其進(jìn)行純化，并對(duì)其進(jìn)行純度、蛋白含量和效價(jià)測(cè)定。采用改良過(guò)碘酸鈉法，將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記于純化的單克隆抗

6、體，共制備兩批酶標(biāo)單克隆抗體，批號(hào)分別為MK01、MK02，并進(jìn)行性狀、無(wú)菌及活性檢驗(yàn)，并對(duì)其保存期進(jìn)行研究。制備的腹水純化后，純度分別為92.3％和91.8％，蛋白含量為2.65mg/ml、2.85mg/ml，間接ELISA效價(jià)分別為1∶25600和1∶51200。將純化后的單克隆抗體標(biāo)記HRP，標(biāo)記后單克隆抗體為澄清，無(wú)絮狀物，均無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)，稀釋3000倍后，其OD性狀為OD450nm＞1.0。單克隆抗體-80℃保存30個(gè)月，

7、酶標(biāo)單克隆抗體-20℃保存30個(gè)月，抗體效價(jià)或活性未降低。
　　通過(guò)對(duì)不同配方的包被液、封閉液、酶稀釋液的對(duì)比試驗(yàn)，確定使用PB(0.2mol/L，pH值7.4）緩沖液作為重組PCV2 Cap蛋白的包被液，20％小牛血清作為封閉液，20％小牛血清、0.1％Proclin300的PB（0.02mol/L，pH值7.4）緩沖液作為酶稀釋液。
　　在北京熱景生物技術(shù)有限公司GMP車(chē)間試制了5批豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒