下丘腦-垂體-卵巢軸系衰老機理及何首烏飲延緩衰老的實驗研究.pdf

1、傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認為腎虛是衰老的主要原因。我們根據(jù)腎虛衰老學(xué)說確立了補腎填精原則，制定了補腎方劑-何首烏飲。本研究首先建立D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老大鼠模型，以大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸(H-P-O-A)為研究對象，應(yīng)用生化、高效液相、ELISA、RT-PCR、Western blotting、TUNEL、免疫組化方法等檢測抗氧化能力、血脂、神經(jīng)遞質(zhì)、性激素及其受體、卵巢細胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因fas/fasl、Bcl-2/Bax蛋白、Casp

2、ase-3蛋白表達，旨在從生化-組織-細胞-基因-蛋白水平等不同層面系統(tǒng)研究在衰老過程中，下丘腦-垂體-卵巢軸的衰老變化以及何首烏飲延緩衰老作用情況，為進一步闡明女性衰老機制奠定基礎(chǔ)，同時為研究和開發(fā)臨床抗衰老用藥積累資料。 第一部分衰老大鼠血清抗氧化能力和血脂的變化及何首烏飲的影響 目的: 探討 D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠抗氧化能力和血脂的變化，觀察何首烏飲對衰老大鼠抗氧化能力和血脂的影響。 方法:

3、 1.模型的建立及分組(1) 衰老模型的建立：選用清潔級8周齡雄性SD大鼠105只，體重180～220g(由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供)。按300mg/kg/d腹腔注射D-半乳糖(用生理鹽水配成6％的溶液)，連續(xù)60d。 (2) 實驗分組：根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵蠓纸M情況如下，正常對照組(15只)；將造模成功的大鼠分為模型組(15只)、何首烏飲延緩衰老組(高、中、低劑量組各15只)、自然恢復(fù)組(15只)、VE陽性對照組(15只)。

4、 2. 各實驗組大鼠經(jīng)內(nèi)眥取血，離心取上清，①分別用生物化學(xué)方法檢測血清SOD、GSH-Px和T-AOC活力以及MDA的含量。②檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL-C)的含量。 結(jié)果: 1. 大鼠血清抗氧化能力的改變：D-半乳糖所致亞急性衰老模型組SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC均明顯下降，MDA含量明顯上升，與正常對照組比較差異顯著(P＜0.05)，與自然恢復(fù)組比較無差異(P＞0.

5、05)，何首烏飲延緩衰老組SOD活力、GSH-PX活力和T-AOC三者均有顯著提高，MDA含量明顯下降，與模型組比較差異顯著，其含量接近正常組，與自然恢復(fù)組比較差異顯著(P＜0.05)，何首烏飲延緩衰老組和陽性對照組相比較，何首烏飲高劑量效果最好。 2. 大鼠血清血脂的變化：D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠模型組和正常組相比，TC、TG含量明顯升高，HDL-C明顯下降；何首烏飲延緩衰老高劑量組TC、TG含量均有顯著下降，HDL-C含

6、量明顯升高，與自然恢復(fù)組比較差異顯著(P＜0.05)。 結(jié)論: 1. 應(yīng)用D-半乳糖成功建立了衰老模型。 2. 何首烏飲可顯著提高D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠血清SOD、GSH-PX抗氧化酶活性，從而提高總抗氧化能力，減少血清MDA的堆積。 3. 何首烏飲顯著降低亞急性衰老大鼠血清TC、TG含量，提高HDL-C含量，從而改善衰老時脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)。 第二部分雌性衰老大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化及何

7、首烏飲對其影響的研究 目的: 通過檢測各組大鼠下丘腦內(nèi)GnRH、SP、β-EP和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NA、DA、5-HT的含量，分析下丘腦衰老時神經(jīng)遞質(zhì)的變化及何首烏飲延緩下丘腦衰老的作用機制。 方法: 1. 大鼠斷頭取下丘腦，采用ELISA法檢測各組大鼠SP、β-EP和GnRH的含量。 2. 采用高效液相色譜法(HPLC)以SHIMADZU-10A高效液相色譜儀和L-ECD-6A電化學(xué)檢測器檢測下丘腦單胺類神

8、經(jīng)遞質(zhì)NA、DA、5-HT的含量。 結(jié)果: 1. 下丘腦GnRH、SP和β-EP的變化：模型組下丘腦GnRH、SP明顯增高，β-EP明顯降低，與正常組相比有顯著差異(P<0.05)；模型組與自然恢復(fù)組之間比較差異無顯著性(P>0.05)；何首烏飲能夠明顯提高β-EP的含量，降低GnRH、SP的濃度，何首烏飲高劑量組明顯好于其它各組(P<0.05)。 2. 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化：模型組大鼠下丘腦NA、DA、5-H

9、T與正常組相比，含量明顯下降(P<0.05)；何首烏飲組同模型組相比，NA、DA、5-HT含量明顯提高。以何首烏飲高劑量組效果最顯著。 結(jié)論: 1. 本研究驗證了衰老大鼠下丘腦合成NA、DA、5-HT和β-EP減少，GnRH、SP增加，證實下丘腦正常功能被破壞。 2. 何首烏飲能上調(diào)下丘腦β-EP的含量，下調(diào)GnRH、SP的濃度，提高NA、DA、5-HT濃度。由此可見何首烏飲通過對神經(jīng)遞質(zhì)紊亂的調(diào)節(jié)而延緩了下丘腦

10、的衰老。 第三部分衰老大鼠性激素與其受體的變化以及何首烏飲對其影響的研究 目的: 通過免疫組織化學(xué)全自動微粒子化學(xué)發(fā)光法、原位雜交和蛋白印記等技術(shù)觀察亞急性衰老雌性大鼠性激素及其受體的變化情況和何首烏飲延緩卵巢組織的衰老作用。 方法: 1. 臟器指數(shù)大鼠處死前稱重量。電子分析天平稱量大鼠的垂體、卵巢濕重量。垂體指數(shù)=垂體濕重/體重×100％，卵巢指數(shù)=卵巢濕重/體重×100％。 2. 通過全自動微

11、粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測各組大鼠血清LH，E2，F(xiàn)SH的含量變化。 3. 鼠經(jīng)含1‰ DEPC的4％多聚甲醛灌注固定，取卵巢，常規(guī)石蠟包埋，原位雜交方法檢測各組大鼠卵巢細胞FSHR和LHR的變化情況。 4. 大鼠斷頭處死，取卵巢，Western Bloting法檢測各組大鼠卵巢ER的變化。 結(jié)果: 1. 血清性激素含量：模型組血清E2含量明顯降低、LH、FSH升高，與正常組比較有顯著差異(P<0.05

12、)；與自然恢復(fù)組相比無顯著差異(P>0.05)；何首烏飲延緩衰老高、中劑量組能夠顯著提高血清E2和降低LH、FSH的含量(P<0.05)，其作用強于VE對照組。 2. 垂體和卵巢指數(shù)：模型大鼠同正常對照大鼠相比，垂體指數(shù)和卵巢指數(shù)均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和何首烏延緩衰老組均增高(P<0.05)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。 3. 卵巢細胞中激素受體的變化：模型組ER、FSHR、LHR的表達與正常組相比

13、明顯降低(P<0.05)；模型組與自然恢復(fù)組之間無明顯差異(P>0.05)；何首烏飲延緩衰老不同劑量組均能明顯提高卵巢細胞ER、FSHR、LHR的表達，且成量效關(guān)系，隨著劑量的增加效果更佳。 結(jié)論: 1. 衰老大鼠垂體、卵巢指數(shù)下降，何首烏飲能提高亞急性衰老大鼠垂體、卵巢指數(shù)，使血清E2水平呈升高趨勢，說明何首烏飲有類雌激素作用。 2. 何首烏飲能調(diào)節(jié)亞急性衰老大鼠體內(nèi)的性激素水平，對HPOA的多環(huán)節(jié)具有不同程度

14、的調(diào)節(jié)作用，可升高血清E2水平，降低衰老時大鼠升高的血清FSH和LH水平，從而有助于恢復(fù)HPOA內(nèi)分泌功能的協(xié)調(diào)性。 3. 衰老大鼠性激素受體水平下降，何首烏飲能上調(diào)性激素受體的水平，有利于相關(guān)激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，使HPOA內(nèi)分泌功能恢復(fù)正常，從而改善卵巢功能。 第四部分衰老大鼠卵巢細胞凋亡以及何首烏飲對其干預(yù)效應(yīng)的研究 目的: 通過卵巢細胞凋亡及其相關(guān)基因和蛋白的檢測，探討衰老時卵巢顆粒細胞凋亡情況及何首烏飲的

15、影響。 方法: 1.采用TUNEL法檢測各組大鼠卵巢細胞凋亡情況； 2.RT-PCR方法檢測fas、fasl基因的表達變化。 3.免疫組織化學(xué)方法或Western Blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bel-2、Caspase-3表達量的變化。 結(jié)果: 1.凋亡：模型組卵巢細胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.05)，與自然恢復(fù)組無差異(P>0.05)；何首烏飲延緩衰老組較模型組凋亡

16、率明顯下降(P<0.05)，呈現(xiàn)量效關(guān)系，以何首烏飲高劑量組效果作用最佳。 2.凋亡相關(guān)基因和蛋白表達情況：模型組較正常組卵巢細胞fas、fasl基因表達增強，Bax、Caspase-3表達量增加，Bcl-2表達減弱；何首烏飲可使卵巢fas、fasl基因表達減弱，Bax、Caspase-3表達量降低，Bcl-2表達增加。 結(jié)論: 1.衰老時大鼠卵巢由于凋亡促進基因Bax、fas、fasl、Caspase表達增加，

17、抑制基因Bcl-2表達降低而導(dǎo)致卵巢顆粒細胞凋亡率增加，造成卵泡閉鎖加劇。 2.何首烏飲通過降低卵巢細胞凋亡和調(diào)控凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達而達到延緩卵巢細胞衰老的目的。 綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖致衰老大鼠HPOA及相關(guān)生化指標(biāo)發(fā)生了一系列衰老變化。何首烏飲通過改善(1) 提高機體抗自由基和調(diào)節(jié)血脂的能力，(2) 下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)GnRH、SP、β-EP、NA、DA、5-HT含量；(3) 性激素的分泌及受體的表達；