苜蓿DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的研究.pdf

1、本論文主要對(duì)苜蓿中的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行了研究。分別以4℃寒冷脅迫處理的黃花苜蓿、紫花苜?？俁NA為模板,運(yùn)用RACE技術(shù)和RT-PCR方法,擴(kuò)增得到黃花苜蓿逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MfDREB1基因、MfDREB1s基因和紫花苜蓿逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MsDREB1基因全長(zhǎng)cDNA。將以上3個(gè)基因cDNA進(jìn)行克隆與序列分析,序列分析表明MfDREB1基因cDNA長(zhǎng)952 bp,包含一個(gè)651 bp的開放閱讀框,編碼一條含216

2、個(gè)氨基酸的多肽,分子量約為24.6 kDa,等電點(diǎn)為5.95;MfDREB1s基因cDNA長(zhǎng)744bp,包含一個(gè)555bp的開放閱讀框,編碼一條含184個(gè)氨基酸的多肽,分子量約為20.8kDa,等電點(diǎn)為9.11;MsDREB1基因cDNA長(zhǎng)902bp,包含一個(gè)長(zhǎng)651 bp的開放閱讀框,編碼一條含216個(gè)氨基酸的多肽,分子量約為24.9 kDa,等電點(diǎn)為6.11。Protein Blast數(shù)據(jù)顯示,以上3條多肽均屬于EREBP/AP2家

3、族DNA結(jié)合蛋白的典型成員。 進(jìn)一步分別克隆了MfDREB1、MfDREB1s和MsDREB1的基因組DNA,序列分析表明以上3個(gè)基因均無(wú)內(nèi)含子?；蚪MSouthern blot分析表明,MfDREB1和MfDREB1s基因在黃花苜?；蚪M中共有3個(gè)拷貝,MsDREB1基因在紫花苜蓿基因組中以2拷貝存在。Northern blot結(jié)果表明MfDREB1和MfDREB1s基因的表達(dá)可受低溫脅迫的誘導(dǎo)。擬南芥rd29A基因的表達(dá)受干

4、旱、高鹽及低溫的誘導(dǎo)。rd29A基因啟動(dòng)子區(qū)中含有與上述環(huán)境脅迫應(yīng)答相關(guān)的DRE順式作用元件,該啟動(dòng)子可以感受環(huán)境脅迫,啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)。本研究以擬南芥基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到長(zhǎng)937bp的rd29A啟動(dòng)子片段。為下一步外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的誘導(dǎo)表達(dá)奠定基礎(chǔ)。 為建立簡(jiǎn)便易行、費(fèi)用低廉的紫花苜?；蜣D(zhuǎn)化技術(shù),以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)為受體材料,以含Gus基因的植物雙元表達(dá)載體為外源基因供體進(jìn)

5、行了花粉管通道法轉(zhuǎn)基因的研究。授粉后分別于6h、9h、12h、20h、24h、28h、32h、48h時(shí)滴加DNA溶液,待莢果成熟后收獲轉(zhuǎn)化種子。對(duì)T0代植株進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示授粉后20至48h范圍內(nèi)導(dǎo)入均可得到較高的轉(zhuǎn)化頻率,其中授粉后32h滴加DNA溶液所得的轉(zhuǎn)化率最高(16.7％)。 本研究對(duì)紫花苜蓿組織培養(yǎng)作了系統(tǒng)研究,建立了一套高效穩(wěn)定的紫花苜蓿再生體系。運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將超表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)MfDREB1基因的植物雙