豬圓環(huán)病毒2型SH毒株增殖條件的優(yōu)化與免疫原性穩(wěn)定性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)有2種基因型，即PCV1和PCV2，其中PCV1不引起感染豬發(fā)病，而PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，它還與豬繁殖障礙(reproductive failure)、豬皮炎與腎病綜合癥(porcine dermatitis andnephropathy syndrome

2、，PDNS)和呼吸道疾病綜合癥(porcine respiratory diseasesyndrome，PRDS)有關(guān)，這些疾病被通稱為PCV2相關(guān)性疾病(PCVD)。目前，PCVD給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失，但我國尚無商品化PCV2疫苗。 PK-15細(xì)胞通常被用來體外增殖PCV2，但PCV2在其上增殖滴度較低且不穩(wěn)定，用300mM的D-氨基葡萄糖處理病毒可以增加PCV2復(fù)制，同時會使細(xì)胞發(fā)生退行性變化。為了獲得高滴度病毒，

3、本研究采用逐步降低細(xì)胞維持液中D-氨基葡萄糖的濃度，以篩選刺激病毒增殖的最佳濃度，并且通過優(yōu)化IPMA試驗(yàn)條件，用于測定PCV2在PK-15細(xì)胞上的增殖情況。結(jié)果為，在維持液中加入1-2mMD-氨基葡萄糖既能有效的刺激病毒的復(fù)制，又不影響細(xì)胞的活性和傳代，接種PCV2后37℃培養(yǎng)72h病毒滴度最高。將PCV2連續(xù)傳代至第50代，收獲F20和F50病毒液，其TCID50達(dá)到106.25/ml。 為了進(jìn)一步研究該病毒的免疫原性是否穩(wěn)

4、定，我們將F20和F50的兩個代次的病毒液用0.2％的甲醛37℃作用16h，然后取病毒液接種PK-15細(xì)胞，盲傳3代，用PCR方法檢測滅活效果，然后制成兩個不同代次的油乳劑滅活疫苗。取23頭30日齡PCV2陰性普通斷奶仔豬，隨機(jī)分為4組，第1，2，3組每組6頭，第四組5頭。第1組和第2組分別免疫兩個不同代次的疫苗，第3組為非免疫攻毒組；第4組為空白對照組。免疫組每頭豬肌肉注射2ml滅活疫苗，首免后第21天加強(qiáng)免疫1次。首免后每周采血，測

5、定ELISA抗體。除空白對照組外，其余豬在第42天攻毒PCV2，攻毒后4、7和11、19天用鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和巰基乙酸培養(yǎng)基進(jìn)行免疫刺激，隔離飼養(yǎng)觀察，30天后全部宰殺。攻毒后通過ELISA抗體、攻毒后臨床表現(xiàn)及體溫變化、剖解時的病理變化、相對日增重、病毒血癥及排毒情況等指標(biāo)評價疫苗效果。結(jié)果為，兩個代次的疫苗均能產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，抗體水平相差不大。攻毒后，兩個免疫組的豬均無明顯臨床癥狀，而非免疫攻毒組有明顯的異常臨床表現(xiàn)，增

6、重緩慢，攻毒對照豬平均體溫高于免疫豬，空白對照豬在整個攻毒期中體溫始終保持正常。攻毒后免疫豬及空白對照豬平均體重均升高，而攻毒對照豬平均體重有所降低，且兩免疫組和空白對照組之間相對日增重差異不顯著。病毒血癥檢測表明，攻毒21天后未在免疫豬血清中檢測到PCV2，而在4頭攻毒對照豬血清中都檢測到了PCV2。并且兩個免疫組的豬的剖檢病理變化和病理組織學(xué)變化都明顯比非免疫攻毒組要輕。以上結(jié)果表明，PCV2-SH株具有穩(wěn)定的免疫原性，可以提供有效