菌寄生真菌纖細(xì)齒梗孢蛋白酶基因克隆與表達(dá).pdf

1、生物之間的相互識別及信號傳導(dǎo)一直以來都是生命科學(xué)研究的重要領(lǐng)域。菌寄生真菌與其寄主之間的相互作用是自然界普遍存在的一種生命現(xiàn)象。我們可以通過研究菌寄生真菌與寄主之間的相互作用來揭示生物之間的相互作用的分子機(jī)制。纖細(xì)齒梗孢(Olpitrichum tenellum)是一種活體營養(yǎng)接觸型菌寄生真菌,其寄主包括Fusarium moniliforme,Alternaria alternata等。我們實(shí)驗(yàn)室一直在努力以其為基礎(chǔ)研究菌寄生真菌與寄

2、主真菌之間的相互作用的分子機(jī)制。細(xì)胞壁是細(xì)胞和細(xì)胞之間相互作用的第一道屏障,細(xì)胞壁蛋白研究已經(jīng)成為生物間相互識別機(jī)制研究的熱點(diǎn)。近年來,菌寄生真菌蛋白酶在菌寄生過程中的作用被人們逐漸重視起來。克隆和表達(dá)菌寄生真菌的蛋白酶編碼基因變得很有意義。 絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶。在生物體中絲氨酸蛋白酶超家族成員執(zhí)行多種多樣的生理功能,在很多致病過程以及細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要作用。通過分析絲狀真菌絲氨酸

3、蛋白酶氨基酸序列,我們發(fā)現(xiàn)絲狀真菌絲氨酸蛋白酶催化區(qū)的氨基酸序列非常保守。根據(jù)絲狀真菌絲氨酸蛋白酶的同源保守序列設(shè)計(jì)兼并引物,通過RT-PCR及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了該蛋白酶的編碼基因mppro,全長cDNA包含3’、5’非編碼區(qū)為2024bp,包含一個(gè)1554bp的ORF,編碼517個(gè)氨基酸,該基因在GenBank中注冊的登記號為EU368754。 通過生物信息學(xué)的方法對獲得的蛋白酶的編碼基因mppro

4、的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了序列分析,通過分析發(fā)現(xiàn)mppro編碼的蛋白是一種分泌型的絲氨酸蛋白酶,它屬于與絲氨酸蛋白酶S8家族的枯草桿菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信號肽-前肽-成熟肽的結(jié)構(gòu),并且和菌寄生真菌較多的木霉屬真菌絲氨酸蛋白酶相似性很高,這可能是因?yàn)槠涠紴榫纳婢嘘P(guān)。 將經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的mppro基因和原核表達(dá)載體pET-22b(+)進(jìn)行連接,構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET/mppro

5、,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4～5h,目的蛋白得到大量表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測,在約31kDa處有一條明顯的蛋白帶；而空質(zhì)粒pET-22b(+)轉(zhuǎn)化BL21經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后無相應(yīng)蛋白產(chǎn)生。原核表達(dá)后的蛋白沒有活性,可能由于表達(dá)的蛋白以包涵體形式出現(xiàn)。 mppro基因和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K雙酶切后體外連接,構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/mppro并測序,保證正確的閱讀框。將重組表達(dá)質(zhì)

6、粒pPIC9K/mppro和pPIC9K空質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Xba I(位于HIS4區(qū)內(nèi))線性化后,采用電擊法轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞,于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測篩選整合子,進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng),甲醇誘導(dǎo)5d酶活性達(dá)到最高,達(dá)153U/mL。SDS-PAGE電泳檢測,在約39kDa處有一條明顯的蛋白帶,蛋白大小與從該蛋白酶氨基酸序列估計(jì)的蛋白分子量相符；對轉(zhuǎn)