副豬嗜血桿菌hxuCBA基因簇克隆表達及其免疫特性研究.pdf

1、由副豬嗜血桿菌(Haemophlius parasuis，HPS)引起的Gl(a)sser's病已經(jīng)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。鐵幾乎是所有生物體不可或缺的微量營養(yǎng)元素，它可以作為多種生物過程的電子受體或供體發(fā)揮作用。血紅素是細菌重要的鐵源之一，由hxuCBA基因簇組成的hxu血紅素攝取系統(tǒng)是副豬嗜血桿菌獲取鐵源的途徑之一。本文通過對組成該系統(tǒng)的三個基因進行克隆表達，并分別對表達產(chǎn)物進行了生物信息學分析、免疫原性、免疫保護性、抗血清殺菌等

2、研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.HPS hxuCBA基因簇的克隆、鑒定及分析
　　針對HPS hxuC、hxuB、hxuA基因（組成hxu血紅素攝取系統(tǒng)的基因）分別設計一對引物（各基因片段中信號肽序列已去除），基因片段大小分別為2064bp、1617bp、2847bp。通過PCR的方法從HPS四川M-3分離株的基因組中擴增得到hxuC、hxuB、hxuA基因，分別構建pMD19-T-C、pMD19-T-B、pMD19-T-

3、A重組克隆質(zhì)粒，三種質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定顯示突變堿基未形成終止密碼子，與HPS SH0165菌株的核苷酸序列一致性分別達99.22％、99.13％、98.11％, hxuC和hxuB基因序列無堿基缺失，hxuA基因序列有6個堿基缺失。
　　對HPS HxuC、HxuB、HxuA氨基酸序列進行生物信息學分析，結(jié)果顯示HxuC、HxuB、HxuA成熟期蛋白分別由688、539、949個氨基酸組成，蛋白大小分別為78.07kDa、60.72k

4、Da、105.72kDa，等電點分別為9.23、9.34、6.36，均無跨膜區(qū)存在。三種蛋白的二級結(jié)構均由無規(guī)則卷曲(30.81％、30.80％、38.78％)、延伸鏈(19.48％、28.76％、29.08％)、α螺旋(40.55％、28.57％、22.13％)和β轉(zhuǎn)角(9.16％、11.87％、10.01％)組成。HxuC和HxuB屬于外膜蛋白，HxuA屬于胞外蛋白。通過功能位點預測分析，三種蛋白均含有多個糖基化、磷酸化位點，另外H

5、xuC、HxuB、HxuA分別含有1個TonB依賴受體蛋白信號2位點、1個ATP/GTP結(jié)合位點基序A（P環(huán)）、1個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列?？乖砦环治鲲@示HxuC、HxuB、HxuA蛋白均含有多個抗原決定簇位點，并且分別有30、20、38個與細胞毒性T細胞結(jié)合的抗原表位位點。同時對HxuC進行同源建模，發(fā)現(xiàn)HxuC蛋白在同種間同源性很高，而在同屬與同科間同源性很低。
　　2.HPS hxuCBA基因簇的表達及純化
　　利用BamH

6、Ⅰ和NcoⅠ對pMD19-T-C、pMD19-T-B、pMD19-T-A和pET39b進行雙酶切，16℃進行連接，構建pET39-C、pET39-B、pET39-A重組表達質(zhì)粒，將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coil(BL21)表達菌內(nèi)進行誘導表達。優(yōu)化蛋白表達條件的結(jié)果顯示，HxuC經(jīng)37℃，0.2 mmol/L IPTG濃度誘導6h達到最大表達量，HxuB經(jīng)37℃，1.2mmol/L IPTG濃度誘導3h達到最大表達量，HxuA在30℃，I

7、PTG誘導濃度0.8mmol/L誘導2h表達量最大。經(jīng)SDS-PAGE顯示三種重組蛋白均可以可溶性和包涵體形式存在，分子量大約為105 kDa、87 kDa、130 kDa（含載體部分）。然后通過鎳離子親和層析法純化得到目的蛋白，純化的蛋白經(jīng)透析后進行western-blot，結(jié)果表明三種蛋白均具有良好的反應原性。
　　3.HPS HxuC、HxuB、HxuA蛋白的免疫特性研究
　　以昆明小鼠作為實驗動物，用自制的HxuC、

8、HxuB、HxuA、HxuCBA(包含HxuC、HxuB、HxuA)疫苗和HPS M-3全菌滅活苗進行皮下注射免疫。一免后第14天進行二免。一免和二免分別用弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。并分別用佐劑和PBS作為對照。每次免疫后7天對小鼠進行斷尾收集血清。通過ELISA的方法檢測抗體水平和細胞因子水平，結(jié)果顯示小鼠抗HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3血清的抗體效價分別達到1∶6400、1∶3200、1∶1600、1∶128

9、00、1∶12800;相比于免疫前，細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平均有所升高，而且一免和二免結(jié)果呈現(xiàn)遞增趨勢。
　　本研究進行了抗血清殺菌實驗，結(jié)果顯示HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3、佐劑、PBS組的細菌存活率分別為28.2％、32.3％、38.6％、35.1％、28.5％、46.9％、48.3％。由此可見，HxuC、HxuB、HxuCBA對HPS M-3有明顯的抗菌作用，而HxuA的抗菌作用相對

10、較弱。以昆明小鼠作為實驗動物，測出HPS M-3菌株的半數(shù)致死量LD50，約為1.3×109cfu。隨后進行了攻毒保護試驗，免疫程序同上。另外設立全菌滅活免疫組。二免后第7天對小鼠進行腹腔攻毒(5×LD50)，攻毒后統(tǒng)計小鼠發(fā)病死亡狀況。結(jié)果顯示PBS對照組和佐劑對照組小鼠全部死亡，HxuC、HxuB、HxuA、HxuCBA、M-3免疫組保護率為87.5％、62.5％、37.5％、75.0％、87.5％。另外，這三種蛋白均能減少副豬嗜血