皺紋盤鮑內(nèi)參基因篩選及C型凝集素基因表達規(guī)律的研究.pdf

1、皺紋盤鮑是一種名貴的海洋經(jīng)濟貝類，伴隨其養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，出現(xiàn)了病害頻發(fā)和種質(zhì)退化等問題，制約著產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。通過研究免疫相關(guān)基因表達規(guī)律，探討皺紋盤鮑免疫機制，可為提高皺紋盤鮑抗病力提供理論參考。實時熒光定量PCR技術(shù)作為一種常用的分子生物學(xué)手段，可以快速、準(zhǔn)確和靈敏的檢測免疫相關(guān)基因的表達規(guī)律，從而了解其表達量的變化，進而探討其功能。但是，基因表達量的分析需要穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行校對，所以內(nèi)參基因的選擇決定著實時熒光定量PCR結(jié)果的

2、準(zhǔn)確性。
　　本研究選取了皺紋盤鮑β-肌動蛋白(ACT)、18S核糖體RNA(18S)、細胞色素b(CYTB)、延伸因子1(EF1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核糖體蛋白S9（S9)和微管蛋白(TUB)等7個候選基因，以實時熒光定量PCR測定了各候選基因在皺紋盤鮑不同組織、不同發(fā)育時期以及受到藤黃微球菌和鰻弧菌刺激后血細胞樣品中的Ct值，利用Bestkeeper、Normfinder和Genorm等內(nèi)參篩選程序分析了各

3、基因表達的穩(wěn)定性；并以篩選出來的穩(wěn)定基因為內(nèi)參基因，檢測了皺紋盤鮑C型凝集素分別在皺紋盤鮑各組織、各發(fā)育時期以及細菌刺激后血細胞中的表達規(guī)律。
　　以內(nèi)參篩選程序分析了各候選基因在皺紋盤鮑鰓、外套膜、性腺、血細胞、肌肉和肝臟等不同組織樣品中的Ct值，通過Genorm和Normfinder分別分析M值和穩(wěn)定值發(fā)現(xiàn)各候選基因穩(wěn)定性由高到低為：ACT>CYTB>18S>TUB>EF1>GAP>S9；Bestkeeper分析標(biāo)準(zhǔn)差顯示各候

4、選基因穩(wěn)定性由高到低為：CYTB>18S>TUB>ACT>EF1>GAP>S9。綜合三種程序穩(wěn)定性排序可以得出：檢測某個基因在皺紋盤鮑不同組織樣品中的表達時，CYTB可作為內(nèi)參基因。
　　通過實時熒光定量PCR技術(shù)獲得皺紋盤鮑2細胞、4細胞、8細胞、16細胞、桑葚期、原腸期，擔(dān)輪幼蟲、面盤幼蟲、匍匐幼蟲和稚鮑等不同發(fā)育時期的各候選基因的Ct值，經(jīng)Genorm和Normfinder分析顯示各候選基因的穩(wěn)定性為ACT>CYTB>TUB

5、＞GAP>18S>EF1>S9；Bestkeeper分析顯示各候選基因穩(wěn)定性為TUB>ACT>GAP>18S>CYTB>S9>EF1。由三種程序綜合分析后得出：檢測某個基因在皺紋盤鮑不同發(fā)育時期樣品中的表達時，ACT可作為內(nèi)參基因。
　　以Genorm、Normfinder和Bestkeeper分析了各候選基因在皺紋盤鮑受到不同細菌刺激后血細胞樣品中的Ct值。①藤黃微球菌刺激后，Genorm和Normfinder分析得出各候選基因

6、穩(wěn)定性由高到低為 ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9；Bestkeeper分析得出各候選基因穩(wěn)定性由高到低為TUB>CYTB>ACT>EF1>18S>GAP>S9。②鰻弧菌刺激后Genorm分析得出各候選基因的穩(wěn)定性為 ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9，Normfinder分析得出各候選基因的穩(wěn)定性為ACT>CYTB>TUB>EF1>GAP>18S>S9，Bestkeeper分析得出各候選基因的

7、穩(wěn)定性為ACT>TUB>CYTB>EF1>18S>S9>GAP。綜合三種程序的分析結(jié)果，在測定某個基因在鰻弧菌或藤黃微球菌后皺紋盤鮑血細胞樣品中表達量時，ACT可作為內(nèi)參基因。
　　利用篩選出來的ACT和CYTB作為內(nèi)參基因檢測了C型凝集素基因在皺紋盤鮑不同組織、發(fā)育時期以及受到藤黃微球菌和鰻弧菌刺激后血細胞樣品中的表達規(guī)律，結(jié)果表明：C型凝集素在不同組織中均有表達，在肌肉和血細胞中表達量最高；在桑葚期明顯上升，至匍匐幼蟲期達到最