小鼠胚胎雌雄原始生殖細胞發(fā)育的比較研究.pdf

1、C57BL/6J小鼠是標準的近交系小鼠,其胚胎期生殖發(fā)育的過程與人的有許多相同之處,而且遺傳背景清楚,便于研究,是胚胎生殖發(fā)育研究較理想的生物模式材料。胚胎組織切片標本的制作與觀察是研究生殖發(fā)育的一個必不可少的重要手段,為形態(tài)學研究與免疫熒光技術等研究提供技術平臺。目前小鼠胚胎的生殖發(fā)育仍有很多難題未被解決,已有的資料大多是通過體外分離培養(yǎng)研究所得,很多體內(nèi)的發(fā)育問題仍困惑著科學家,需要進行更多的研究來解答。C57BL/6J小鼠妊娠期1

2、9-21天,在胚胎第11天至13.5天之間生殖嵴與原始生殖細胞的發(fā)育變化明顯可見。8.5天-10.5天時原始生殖細胞向生殖嵴移動并增殖。11.5天時多半進入生殖嵴,失去其運動能力,并大量增殖。13.5天之后原始生殖細胞在生殖嵴內(nèi)的增殖完成。接著雌性生殖細胞即開始進入減數(shù)分裂,在15.5天大多數(shù)進入第一次減數(shù)分裂并最終停留在前期的雙線期。而雄性生殖細胞則處于靜止狀態(tài),出生后5天再開始有絲分裂。目前國內(nèi)外關于小鼠生殖嵴胚胎發(fā)育形態(tài)學研究的全

3、面報道較少,而且很少有研究關注不同性別之間胚胎期生殖細胞發(fā)育的區(qū)別。本研究以C57BL/6J小鼠胚胎生殖嵴為實驗對象,采用石蠟切片蘇木精-伊紅染色、免疫熒光組織化學法以及蛋白印跡分析等方法,研究C57BL/6J小鼠在11天至13.5天之間生殖嵴發(fā)育的形態(tài)學改變以及雌性和雄性之間原始生殖細胞在數(shù)量與增殖率的區(qū)別,初步探討正常C57BL/6J小鼠雌性與雄性原始生殖細胞發(fā)育的區(qū)別,為生殖胚胎發(fā)育的分子水平調(diào)控的深入研究提供了依據(jù)。
　　

4、 一、鼠整胚組織切片標本的制作與觀察
　　 分別取不同天數(shù)的小鼠胚胎(11天,11.5天,12天,12.5天,13天,13.5天),每個胚胎取少量組織PC R法鑒定胚胎性別。整胚組織采用4％多聚甲醛固定液固定,接著從低濃度乙醇開始梯度脫水,二甲苯透明,浸蠟后包埋,5um連續(xù)切片。石蠟塊切片后做HE染色。選擇含有生殖嵴的切片,光學顯微鏡下觀察11天至13.5天胚胎生殖嵴的組織形態(tài)學變化以及性別分化特征。組織切片觀察發(fā)現(xiàn),小鼠胚胎

5、的細胞與組織的形態(tài)被很好的展現(xiàn)出來,我們能很輕松的觀察到從11天至13.5天生殖嵴形態(tài)結構上的改變、胚胎性別分化的特征以及原始生殖細胞的形態(tài)。
　　 結果發(fā)現(xiàn),小鼠胚胎11-13.5天生殖嵴的發(fā)育迅速。11天的鼠胚生殖嵴已經(jīng)形成,且其中可見遷移來的原始生殖細胞。原始生殖細胞體積大,核大且呈圓形或卵圓形。11.5天鼠胚,生殖嵴變厚變長。12天的鼠胚生殖嵴性別尚未分化。12.5天的鼠胚開始出現(xiàn)性別分化的跡象。13天的鼠胚性別明顯分化

6、,雄性的原始性索開始分化為實心原始生精小管。13.5天的鼠胚,雄性原始生精小管結構明顯,雌性皮質(zhì)索孤立細胞團形成原始卵泡。生殖嵴石蠟切片的制作,可以為生殖嵴免疫熒光研究提供材料,為更進一步研究小鼠胚胎生殖發(fā)育以及原始生殖細胞的發(fā)育提供了實驗依據(jù)。
　　 二、生殖嵴中原始生殖細胞的免疫熒光組織化學檢測
　　 雌雄性生殖細胞特異性表達小鼠脈管同系物(Mouse vasa homolog,Mvh)。采用免疫熒光雙染的方法用Mv

7、h抗體標記原始生殖細胞,用增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)標記處于增殖中的細胞。從每個胚胎的連續(xù)切片中間隔選取3-4張切片進行免疫熒光雙染,拍照后截取相同大小的面積,計數(shù)Mvh陽性與Mvh與PCNA共陽性的細胞數(shù),即原始生殖細胞數(shù)與正處于增殖中的原始生殖細胞數(shù)。根據(jù)后者與前者的比值計算出原始生殖細胞的增殖率。
　　 結果發(fā)現(xiàn),11天生殖嵴面積小,未參與計數(shù)。對于原始

8、生殖細胞的數(shù)量與增殖率,11.5天-12.5天的雌性和雄性胚胎之間都沒有顯著差別(P>0.01),但其數(shù)量在雄性13天(135.83±4.57)和13.5天(152.23±5.54)顯著多于雌性13天(97.08±4.72)和13.5天(121.22±9.27)(P=0.000),增殖率在13天雄性(20.23±0.34％)較雌性(16.95±0.35％)高(P=0.000),13.5天沒有顯著區(qū)別(P>0.01)。雌性和雄性胚胎原始生

9、殖細胞的增殖率都在13天最高,數(shù)量在13.5天最多。
　　 三、蛋白印跡法檢測生殖嵴中Mvh和PCNA蛋白的表達
　　 取13天、13.5天胚胎的生殖嵴,提取蛋白做蛋白印跡檢測,分析比較雌性與雄性Mvh與PCNA蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn):以β-tubulin為內(nèi)參,Mvh蛋白的表達在13天與13.5天雄性顯著高于雌性,PCNA表達在13天雄性也高于雌性,13.5天沒有顯著區(qū)別。說明13天、13.5天雄性原始生殖細胞數(shù)量較雌性