全基因組篩選胰腺癌耐藥相關(guān)基因.pdf

1、目的:通過可四環(huán)素調(diào)控的全基因組隨機突變的方法,篩選胰腺癌健擇(GEM,Gemcitabine)耐藥的關(guān)鍵基因和遺傳通路,同時結(jié)合干細胞研究技術(shù),深入了解胰腺癌化療耐藥的分子機制及其與腫瘤干細胞之間的可能聯(lián)系,以確定新的聯(lián)合治療的靶點,為胰腺癌提供新的治療策略。
　　 方法:首先將含有四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活子(transactivator,tTA)的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人胰腺癌細胞系PANC-1和CAPAN-1細胞中,經(jīng)

2、熒光素酶報告基因檢測建立可調(diào)控的Tet-off穩(wěn)定表達細胞系,再構(gòu)建含有tTA結(jié)合元件(tet Operater,tetO)的piggyBac質(zhì)粒,通過電穿孔共轉(zhuǎn)染的將piggyBac質(zhì)粒和mPB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Tet-off穩(wěn)定表達細胞系,通過G418藥物篩選獲得全基因組范圍內(nèi)的隨機基因突變文庫。在四環(huán)素存在或者不存在時,對GEM反應(yīng)的差異具有統(tǒng)計學意義的細胞表型,通過自連克隆法或Splinkerete PCR法進行基因克隆及相關(guān)的功能驗證；

3、同時結(jié)合干細胞相關(guān)技術(shù),通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將四個干細胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入Tet-off穩(wěn)定表達細胞系中,誘導(dǎo)干細胞樣細胞形成,觀察其對GEM的藥物反應(yīng)的變化。
　　 結(jié)果:建立了三個Tet-off穩(wěn)定表達且可調(diào)控的胰腺癌細胞系,即PC68-PANC1,PC248-PANC1和2D2-CAPAN-1細胞系；成功構(gòu)建了piggyBac基因搜尋載體TNO—PB,其Tet-off穩(wěn)定表達細胞系中,建立全基因組隨機基因突變文庫

4、；篩選對GEM的反應(yīng)在Dox調(diào)控下有顯著性差異的細胞克隆12個,進一步基因克隆得到初步的結(jié)果,并將克隆到的6個基因進行染色體定位和功能分析。同時通過piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將攜帶四個干細胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4,Sox2,c-Myc和Klf4)和tetO的目的基因成功轉(zhuǎn)染進入CAPAN-1—2D2細胞株,得到與ES和iPS細胞克隆形態(tài)相似的CAPAN-1-2D2/iPS樣細胞克隆,對CAPAN-1-2D2/iPS樣細胞克隆進行堿

5、性磷酸酶顯色和X-gal檢測,結(jié)果呈陽性。
　　 結(jié)論:PANC-1-PC68,PANC-1-PC248和CAPAN-1—2D2是人胰腺癌Tet-off穩(wěn)定高表達的細胞系。以此為基礎(chǔ)建立的隨機基因敲除調(diào)控技術(shù)平臺是進行胰腺癌化療耐藥相關(guān)基因篩選行之有效的方法,我們在現(xiàn)有基礎(chǔ)之上將擴大突變文庫的容量,增加胰腺癌化療耐藥相關(guān)基因的篩選范圍,進一步進行候選基因的功能驗證及克隆其它的GEM耐藥相關(guān)基因；通過Oct-3/4、Sox2、c-