菊酯類農(nóng)藥降解酶基因的克隆、表達(dá)及分子改造.pdf

1、擬除蟲菊酯農(nóng)藥是目前僅次于有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的一類殺蟲劑，約占世界殺蟲劑的20％。廣譜性菊酯類農(nóng)藥如氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，其殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了一定的影響。農(nóng)藥殘留已成為突出的環(huán)境問(wèn)題，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。利用微生物降解的方法，解決農(nóng)藥污染尤其是菊酯類農(nóng)藥殘留問(wèn)題，已成為當(dāng)前食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 本文從農(nóng)藥廠的污泥中篩選到7株能降解菊酯類農(nóng)藥的細(xì)菌，并選取了一株降解效能高的菌株ZD112作為

2、本論文的研究對(duì)象。通過(guò)生理生化研究和16SrDNA分子鑒定，初步鑒定該菌株為Klebsiella sp．。根據(jù)已知的文獻(xiàn)資料并結(jié)合GenBank檢索，該菌株為菊酯農(nóng)藥降解的一個(gè)新種。ZD112能以菊酯作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，其降解菊酯的最適溫度是35℃，最佳pH是7.0。研究了外界環(huán)境條件對(duì)菌株Klebsiella sp．ZD112的生長(zhǎng)和降解能力的影響。菌株ZD112產(chǎn)生的菊酯降解酶為胞內(nèi)酶，該降解酶的最適反應(yīng)條件是：最適溫度45℃，最

3、佳pH是6.6，以氯氰菊酯為底物，粗酶的米氏動(dòng)力常數(shù)是：Km=0.33 μmol．Vmax=105.32nmol/min。 為了獲取菌株ZD112的菊酯降解酶基因，本論文構(gòu)建了該菌株的基因組文庫(kù)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化子依次挑取到終濃度100 μg/ml Amp和100μM X-caprylate的LB平板上，挑取藍(lán)色水解圈的菌落用于初步篩選具有菊酯降解活性的轉(zhuǎn)化子。其中一個(gè)含有3.5 kb的HindⅢ酶切片段轉(zhuǎn)化子具有菊酯降解活性，經(jīng)測(cè)序

4、比對(duì)，該片段內(nèi)含一個(gè)由819 bp的開放閱讀框架，編碼272個(gè)氨基酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明為一新的菊酯農(nóng)藥降解酶基因(pyrethroid-hydrolyzing esterase，estP)。同源性分析表明，該ORF與Klebsiella pneumoniae subsp．pneumoniae MGH 78578的乙酰輔酶A硫酯酶Ⅰ有94％的同源性，與Escherichia coli Ell0019的Lysophospholipase L18

5、1％的同源性，其GenBank登錄號(hào)為EU621840。通過(guò)PCR的方法，將estP基因從克隆載體連接到表達(dá)載體pET-32a(+)中，并轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)宿主菌E.coli Origami中。經(jīng)過(guò)活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白具有降解菊酯的活性。SDS-PAGE電泳后在42 kDa處有特異性表達(dá)的蛋白條帶。通過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，在28℃，pH 7.0，IPFG終濃度為0.3 mM，表達(dá)時(shí)間為8 h時(shí)，目的蛋白得到最好表達(dá)，表達(dá)的蛋白為胞內(nèi)酶。酶活力測(cè)

6、定該蛋白具有酯酶活性，且對(duì)氯氰菊酯有較強(qiáng)的降解能力。進(jìn)一步使用Ni2+鰲合劑試劑盒對(duì)表達(dá)蛋白純化。當(dāng)以氯氰菊酯為底物時(shí)，純化EstP Km=0.21 μmol Vmax=120.63nmol/min：以對(duì)硝基苯酚乙酸酯底物法測(cè)定純酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，Km=34.33 μmol．Vmax=220.63 nmol/min。 在研究EstP蛋白性質(zhì)的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高該酶的降解能力，本論文使用隨機(jī)突變?cè)噭┖?GeneMorph Ⅱ R

7、andom Mutagenesis Kit)對(duì)estP進(jìn)行了兩輪易錯(cuò)PCR突變，獲得5000個(gè)突變子的突變文庫(kù)。使用顯色底物進(jìn)行突變子的初步篩選結(jié)合酯酶活性的篩選方法，獲得了2個(gè)在45℃溫度條件下具有高活性的突變基因，其中M223以氯氰菊酯為底物時(shí)，突變的EstP Km=0.19μmol．Vmax=156.44 nmol/min，酶活提高了80％：以對(duì)硝基苯酚乙酸酯底物，測(cè)定突變EstP酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，Km=33.74 μmol．Vma