產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶的純化、特性研究及其基因擴(kuò)增.pdf

1、尿酸是人體嘌呤堿基分解代謝終產(chǎn)物，經(jīng)腎臟排泄。體內(nèi)尿酸生成超過腎臟排泄時(shí)血清尿酸會(huì)顯著升高，造成高尿酸血癥。高尿酸血癥與痛風(fēng)、心血管疾病、腫瘤裂解綜合征及腎臟疾病的引發(fā)或加劇密切相關(guān)。因此，需要開發(fā)有效的藥物來治療高尿酸血癥。當(dāng)前，尿酸酶被認(rèn)為是治療高尿酸血癥相關(guān)疾病的理想藥物。本項(xiàng)目對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母菌及其尿酸酶進(jìn)行了如下研究： 1.產(chǎn)朊假絲酵母菌的培養(yǎng)及其尿酸酶的制備、純化產(chǎn)朊假絲酵母菌(C.GM.C.C.2.1008)經(jīng)一定濃

2、度尿酸誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集菌體，超聲粉碎，離心，取上清即粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后，尿酸酶比活性＞0.32 U/mg蛋白。在DE.AE-cellulose 52柱上，pH 8.0時(shí)此尿酸酶不被吸附，兩次層析后所得比活性達(dá)7.1 U/mg蛋白。 2.尿酸酶的特性研究Sephadex G.200凝膠過濾層析推測(cè)此尿酸酶的分子量為134.0kD。SDS.PAGE分析DEAE-cellulose 52纖維素柱層析兩次所得最高比活性尿酸酶

3、制劑(＞7.0 U/mg蛋白)，發(fā)現(xiàn)此酶只含一種約33.0 kD的多肽，MAILDI-TOF-MS分析最高比活性樣品沒有檢測(cè)到單一肽鏈，而豐度最高成分為67.7 kD，次高成分為131.4 kD。25+0.5℃時(shí)，此尿酸酶最適pH接近8.8，在pH 7.4時(shí)可保留50％以上活性，37℃時(shí)4 h內(nèi)穩(wěn)定，米氏常數(shù)為(32.8±3.1)μmol/L(n=lO)。抑制劑譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)：除腺苷、鳥苷和肌苷對(duì)該尿酸酶無抑制作用外，氧嗪酸鉀的抑制常數(shù)為(

4、1.1±0.1)μmol/L(n=3)，黃嘌呤的抑制常數(shù)為(4.8±0.2) μmol/L(n=3)，鳥嘌呤的抑制常數(shù)為(37.9±4.2)μmol/L(n=3)，次黃嘌呤的抑制常數(shù)為(500.0±60.0)μmol/L(n=3)，腺嘌呤的抑制常數(shù)為(748.9±82.0)μmol/L(n=3)，別嘌呤醇的抑制常數(shù)為(927.6±95.0)μmol/L(n=3)。用蒸餾水透析后失活90％以上，且隨后加NaCl處理后酶活性不能恢復(fù)。1.0

5、mmol/L 碘乙酸30 min內(nèi)可使該尿酸酶完全失活，1.0 mmol/L 的Cu2+和Fe3+ 對(duì)此酶有明顯抑制作用。這些結(jié)果表明此尿酸酶需通過分子工程改造才能用作治療高尿酸血癥相關(guān)疾病的藥物。 3.產(chǎn)朊假絲酵母菌尿酸酶基因的PCR擴(kuò)增、測(cè)序利用試劑盒提取出產(chǎn)朊假絲酵母基因組DNA，設(shè)計(jì)特異引物，優(yōu)化PCR.條件，最終擴(kuò)增出大小與我們預(yù)計(jì)相符的DNA片段。對(duì)此片段進(jìn)行膠回收純化后送去測(cè)序，將正、反向測(cè)序結(jié)果比對(duì)拼接得到最后的