狂犬病病毒CVS-11株全基因組測序及其反向遺傳系統(tǒng)的建立.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus,RV）引起的一種古老而又不可治愈的人畜共患傳染病，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，一旦發(fā)病，100％死亡，疫苗接種是此病預(yù)防的重要措施。
　　狂犬病病毒CVS-11株為WHO認(rèn)定的體外檢測血清中抗狂犬病病毒中和抗體滴度的標(biāo)準(zhǔn)方法--快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）用標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒，CVS-11與血清中狂

2、犬病病毒中和抗體的反應(yīng)水平如何，與CVS-11和疫苗株之間的基因序列及相應(yīng)抗原性的差異大小是密切相關(guān)的。盡管GenBank中已登載了CVS-11株的部分結(jié)構(gòu)蛋白的編碼序列，但至今無CVS-11株全基因組序列的資料。因此，本研究第一部分通過RT-PCR、TA克隆構(gòu)建、基因雙向測序等獲得了CVS-11株的全基因組序列，并提交GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號為GQ918139。
　　CVS-11株的基因結(jié)構(gòu)特征分析，發(fā)現(xiàn) CVS-11株為

3、基因I型狂犬病病毒，其基因組構(gòu)成與GenBank公布的其它毒株全基因組序列基本一致，與其他人提交到GenBank里的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列一致性很高，但也存在與其它毒株不同的特性：M蛋白有兩個poly A尾以及G-L間的假基因區(qū)不明顯。另外，我們利用生物信息學(xué)軟件對CVS-11株與國內(nèi)現(xiàn)用人用狂犬病病毒疫苗株進(jìn)行了同源性比對分析，結(jié)果顯示，無論在基因組整體還是在結(jié)構(gòu)蛋白，PM和CVS-11株的同源性都非常高；而PV、aG、CTN-1以及Flu

4、ry－LEP株，與標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒CVS－11或在基因組整體或在結(jié)構(gòu)蛋白或在某些關(guān)鍵的抗原位點(diǎn)都存在著較大的差異。這種差異從分子生物學(xué)信息層面對Moore等的研究結(jié)果“同源性攻擊病毒所得的RFFIT中和抗體滴度比異源性攻擊病毒所得的RFFIT中和抗體滴度高30％”給予了一定的理論支持，同時也提示我們，各疫苗生產(chǎn)病毒株的關(guān)鍵中和位點(diǎn)與攻擊病毒CVS－11株存在的異同，可能將會影響或直接改變它們的中和抗體活性的模式，也可能影響疫苗效價的檢測結(jié)果。

5、
　　RFFIT試驗(yàn)實(shí)際上就是一個血清中和實(shí)驗(yàn)，指示系統(tǒng)是熒光灶。其熒光灶的產(chǎn)生是由于應(yīng)用了熒光素(FITC)標(biāo)記的抗核蛋白抗體，然而這種熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒抗體通常比較昂貴且高質(zhì)量的此種抗體往往比較緊缺；而且實(shí)驗(yàn)過程需要染色，步驟繁瑣，這就為RFFIT的廣泛應(yīng)用造成了一定的困難。近年來，狂犬病病毒的反向遺傳操作技術(shù)發(fā)展迅速，從需要重組痘苗病毒提供T7RNA聚合酶到不需要痘苗病毒的參與而只需要表達(dá) T7RNA聚合酶的細(xì)胞，到最

6、后不需要T7RNA聚合酶而直接可以利用各種細(xì)胞的RNA聚合酶II，使病毒的拯救從低效到高效，從細(xì)胞種類受限到可廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞。Khawplod等更將綠色熒光蛋白（GFP）報告基因插入狂犬病毒HEP-Flury株的全長cDNA中，成功拯救出攜有GFP基因的重組狂犬病毒 rHEP-GFP，通過在熒光顯微鏡下直接觀察熒光灶的數(shù)量，判斷病毒產(chǎn)生量。
　　為了避免RFFIT試驗(yàn)中熒光素標(biāo)記的狂犬病毒抗核蛋白抗體的應(yīng)用，簡化實(shí)驗(yàn)步驟、降低

7、實(shí)驗(yàn)成本，我們試圖運(yùn)用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，拯救攜有GFP基因的狂犬病病毒 CVS-11株—rCVS-GFP，并希望能將拯救成功的重組病毒株用于RFFIT實(shí)驗(yàn)，以病毒自身表達(dá)GFP呈現(xiàn)的熒光灶為指示系統(tǒng)，判定血清中狂犬病病毒中和抗體的滴度。
　　因此，我們在獲得了標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11全基因組序列的基礎(chǔ)上，在本研究第二部分，構(gòu)建了含GFP基因的狂犬病病毒CVS-11株全長基因組cDNA重組質(zhì)粒-- pCVS-GFP以及病毒拯救所需

8、的三個輔助質(zhì)粒 pVAX-N、pVAX-P、pVAX-M-L。并經(jīng)酶切鑒定、序列測定以及輔助質(zhì)粒在細(xì)胞中的瞬時表達(dá)等實(shí)驗(yàn)證明，以上四個重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于病毒的拯救。在本研究第三部分，我們通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)pCVS-GFP和pVAX-N、pVAX-P、pVAX-M-L四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，拯救重組病毒 rCVS-GFP，經(jīng)過 BHK-21細(xì)胞上三代適應(yīng)性擴(kuò)增后，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)、DF

9、A、IFA、RT-PCR和PCR等實(shí)驗(yàn)證明，重組狂犬病病毒rCVS-GFP拯救成功。
　　重組狂犬病病毒rCVS-GFP的成功拯救，說明狂犬病病毒反向遺傳系統(tǒng)在我們實(shí)驗(yàn)室成功建立，為我們以后研究重組病毒rCVS-GFP與CVS-11的生物學(xué)性狀的異同，開展基于rCVS-GFP的RFFIT實(shí)驗(yàn)等提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；也為我們以后利用反向遺傳學(xué)技術(shù)開展狂犬病病毒基礎(chǔ)研究、篩選基因工程減毒疫苗、建立方便簡潔的疫苗檢定技術(shù)等工作，提供了技術(shù)支持