巨細(xì)胞病毒感染對(duì)大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)致病的初步研究.pdf

1、本研究通過(guò)同種異體大鼠肝臟移植慢性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型的建立，觀察CMV感染對(duì)慢性排斥反應(yīng)的損傷效應(yīng)和對(duì)致纖維增生因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactorβ1、TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowthfactor、PDGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor、bFGF)表達(dá)的影響，及CMV感染對(duì)大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)時(shí)Th1/

2、Th2類細(xì)胞因子(INF-γ、IL-4)表達(dá)的改變，初步探討CMV感染對(duì)慢性排斥反應(yīng)致病的機(jī)制。 目的建立大鼠肝臟慢性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型，比較Th1/Th2類細(xì)胞因子在急、慢性排斥反應(yīng)中的表達(dá)，觀測(cè)CMV感染對(duì)慢性排斥反應(yīng)的損傷作用和TGF-β1、PDGF、bFGF表達(dá)的改變，初步探討CMV感染對(duì)慢性排斥反應(yīng)致病的機(jī)制。 材料與方法近交系雄性DarkAgouti(DA；RT1a)大鼠為供體，近交系雄性BrownNorway

3、(BN；RT1n)大鼠為受體，按照隨機(jī)化的原則，實(shí)驗(yàn)分為四組，A組：急性排斥組，n=20，肝臟移植后不給予處理因素；B組：小劑量環(huán)孢素A(cyclosporineA，CsA)處理組，n=38，肝臟移植后當(dāng)天到移植后30天，皮下注射CsA1mg/kg/d；C組：CMV感染組，n=32，CsA1mg/kg/d皮下注射，從肝臟移植后當(dāng)天到移植后30天，移植后當(dāng)天受體大鼠從腹腔注射人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV

4、)，AD169，0.4ml(30.0logTCID50)；D組：同系對(duì)照組，供受體均為BN雄性大鼠，n=44，同B組CsA處理。所有大鼠在移植后0、1、2天給予氨芐青霉素200mg/kg/d，肌肉注射。每組先取8例行生存率比較，然后于移植后1、6、10、20、30、60天分別處死4-6個(gè)大鼠，取標(biāo)本行組織病理學(xué)檢查，即常規(guī)H&E染色、Masson三色染色法，監(jiān)測(cè)移植術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生，分析排斥反應(yīng)活動(dòng)指數(shù)(rejectionac

5、tivityindex，RAI)；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中HCMV即刻早期蛋白、pp65的表達(dá)和肝臟組織中HCMV早期蛋白、晚期蛋白的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)法檢測(cè)肝臟組織中TGF-β1、PDGF、bFGF、INF-γ、IL-4的mRNA表達(dá)水平和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbenta

6、ssay，ELISA)檢測(cè)它們外周血清中的濃度；并行外周血清肝功能檢測(cè)。 結(jié)果1.生存率比較及移植術(shù)后一般狀況A組大鼠的平均生存期為11.88±2.36天(mean±SD)，中位生存期為12天；B組的平均生存期為58±14.93天，中位生存期為54.5天；C組的平均生存期為41.13±12.45天，中位生存期為41天；D組平均生存期為169.25±48.71天，中位生存期為170.5天。B、C組生存率比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

7、 C組HCMV注射后1-3天，大鼠的一般狀況明顯比其它組大鼠的差，活動(dòng)較少，飲食減少，嗜睡，到HCMV注射后3天，這些癥狀消失，和其它組相比，沒(méi)有明顯差別。2.大鼠肝移植后肝功能變化 大鼠肝移植術(shù)后血清總膽紅素(totalbilirubin，TBIL)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase，ALT)水平在A組和B、C組從移植后第一天開(kāi)始，急劇升高，并維持在較高水平，一直到死亡；在D組，經(jīng)過(guò)短暫的升高后，恢

8、復(fù)到移植前的水平。B組和C組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從30天開(kāi)始，B組和C組與對(duì)照組(D組)相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在B組，從30天開(kāi)始，ALT和TBIL水平明顯升高(P＜0.05)，而在C組，從20天開(kāi)始，ALT和TBIL水平明顯升高(P＜0.05)。 3.移植后病理表現(xiàn)及移植后排斥反應(yīng)病理分析A組H&E染色顯示明顯的急性排斥反應(yīng)，匯管區(qū)因大量的單核細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫顯著腫脹，竇狀隙大量的細(xì)胞浸潤(rùn)引起很多肝板斷裂；炎癥細(xì)胞包括

9、巨噬細(xì)胞、大的嗜派若寧性細(xì)胞和漿細(xì)胞；廣泛的肝細(xì)胞喪失，殘存肝細(xì)胞變性、壞死。淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞穿透基底膜侵入膽管上皮或圍繞膽管分布；膽管上皮胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞極性改變、核固縮、核分裂象增多，嚴(yán)重者細(xì)胞溶解性壞死，細(xì)胞核消失。靜脈內(nèi)皮下淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，靜脈周?chē)霈F(xiàn)中度到重度炎癥，并向肝臟實(shí)質(zhì)延伸。 B、C組從30天始，H&E染色顯示慢性排斥反應(yīng)，表現(xiàn)中度到重度的泡沫細(xì)胞阻塞性動(dòng)脈病變、膽管損傷或消失、細(xì)胞浸潤(rùn)和移植肝纖維化。匯管區(qū)

10、、竇狀隙因密集的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)而腫脹、增大，中度大小動(dòng)脈和小動(dòng)脈內(nèi)膜泡沫細(xì)胞集聚增厚、動(dòng)脈管壁纖維化增厚、管腔變窄甚至閉塞。膽管上皮細(xì)胞核不規(guī)則、細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞局灶壞死、膽管結(jié)構(gòu)因纖維化而完全破壞閉塞甚至消失。匯管區(qū)纖維化，小葉間不完全或完全的纖維隔帶形成，嚴(yán)重者肝臟廣泛纖維化，彌散性肝硬化。 排斥反應(yīng)嚴(yán)重程度分析表明，移植后20天始，B組和C組RAI有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，20天、30天時(shí)，B、C組的平均RAI分別為5.17±1.

11、47、7.17±1.47和8.0±1.67、10.83±2.32(mean±SD)。移植肝慢性排斥反應(yīng)半定量分析結(jié)果顯示：B、C組的膽管損傷雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但C組在30天時(shí)，和對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B、C組的動(dòng)脈阻塞行病變?cè)?0天時(shí)分別為1.33±0.52和2.50±0.55(P=0.006)。B、C組移植肝臟纖維化程度從20天始，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其平均纖維化程度在20天、30天分別為：1.0±0.63、1.67±0.52和2.67

12、±0.52、3.17±0.75。 4.HCMV抗原在移植鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞和肝臟組織的表達(dá)免疫組織化學(xué)證實(shí)：HCMV注射后1天，外周血即刻早期蛋白、pp65的表達(dá)率分別為100％、75％。每20萬(wàn)個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)中的平均陽(yáng)性數(shù)目為19.0±19.97、7.0±6.83。此后，即刻早期蛋白的表達(dá)逐漸下降，至20天時(shí)到達(dá)最低水平，30天時(shí)陽(yáng)性表達(dá)又增多。pp

13、65表達(dá)卻逐漸上升，至10天時(shí)陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)數(shù)目到達(dá)最高水平，每20萬(wàn)個(gè)PBMC中的平均陽(yáng)性數(shù)目為12.0±16.0，陽(yáng)性表達(dá)率80％。20天時(shí)陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)數(shù)目下降至最低水平，30天時(shí)又回升。 HCMV注射后1天，肝臟組織中不能檢測(cè)到HCMV早期抗原和晚期抗原的表達(dá)，至第6天時(shí)，有微量的表達(dá)，10天開(kāi)始輕度增多，到20天、30天時(shí)，移植肝中檢測(cè)到大量HCMV早期抗原和晚期抗原的表達(dá)。 5.肝組織中致纖維增生因子

14、TGF-β1、PDGF、bFGF的mRNA表達(dá)和外周血水平測(cè)定A組大鼠肝組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平和外周血TGF-β1濃度從第1天到第10天，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，從第6天始，顯著高于對(duì)照組表達(dá)水平。B組、C組大鼠肝組織中TGF-β1的mRNA水平自移植后1-10天呈強(qiáng)表達(dá)，雖然B、C二組間相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，但都明顯超過(guò)對(duì)照組的水平，至20天時(shí)，表達(dá)逐漸下降。B、C組外周血TGF-β1表達(dá)水平先短暫增強(qiáng)，后緩慢降低，B組外周血TGF

15、-β1表達(dá)水平在20天以后、C組在6-20天與D組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 A組大鼠肝組織中PDFG的mRNA水平和外周血水平移植后保持在穩(wěn)定水平，各時(shí)點(diǎn)和對(duì)照組相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C組大鼠肝組織中PDFG的mRNA水平和外周血PDFG水平移植后呈逐漸升高趨勢(shì)，移植后6、10天，C組PDGFmRNA表達(dá)顯著高于其它組，移植后20天，顯著高于B、D組。移植后20天時(shí)，C組大鼠外周血PDFG水平顯著高于B組。 A、D組大

16、鼠移植肝bFGFmRNA呈低弱表達(dá)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；B、C二組大鼠肝織bFGF的mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，移植后10天開(kāi)始，B、C二組mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，在移植后20天，C組bFGFmRNA表達(dá)明顯高于B組。B、C組大鼠外周血bFGF水平緩慢逐漸上升，分別至第60天、30天急劇上升，并具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B、C二組相比，外周血bFGF水平在各個(gè)相應(yīng)時(shí)點(diǎn)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，但在B組在第60天、C組在第30天時(shí)，明顯超過(guò)對(duì)照組。

17、 6.肝組織Th1/Th2類細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)和外周血水平測(cè)定A組大鼠肝組織中INF-γ的mRNA表達(dá)水平和外周血INF-γ濃度從第1天到第10天，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，其中，mRNA水平從移植后第6天開(kāi)始明顯高于其它組；在第10天始，INF-γ的血清水平顯著高于其它組。B、C、D三組肝組織INF-γmRNA低弱表達(dá)，C組大鼠肝移植后，外周血INF-γ濃度緩慢持續(xù)上升，移植后20天、30天和對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。B與C組、B與D組相比，外