應(yīng)用PCR及DoT-ELISA技術(shù)建立肝片吸蟲檢測(cè)方法的研究.pdf

1、肝片吸蟲是一種人獸共患寄生蟲，該寄生蟲能夠感染包括人在內(nèi)的許多哺乳動(dòng)物。受片形吸蟲感染的動(dòng)物臨床癥狀主要是急性或慢性肝炎和膽管炎。建立快速、方便且較為特異、靈敏的肝片吸蟲檢測(cè)方法，對(duì)于及時(shí)診斷片形吸蟲病、進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查以及建立片形吸蟲病防控預(yù)警系統(tǒng)有重要作用。
　　本研究建立了基于第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（its-2）基因的肝片吸蟲普通PCR及SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，普通PCR敏感性為

2、212 fg/μl。SYBR Green熒光定量PCR敏感性達(dá)到0.167 fg/μl，比普通PCR高3個(gè)數(shù)量級(jí)，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在0.13％-1.06％之間，組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在0.15％-1.46％之間，均小于2％，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。本研究建立的普通PCR和SYBR Green熒光定量PCR均能以肝片吸蟲基因組為模板擴(kuò)增出目的條帶或擴(kuò)增曲線，與微小隱孢子蟲、羊蛔蟲、小型艾美耳球蟲、大腸桿菌、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組

3、無(wú)交叉反應(yīng)，顯示出較好的特異性。對(duì)浙江嘉興地區(qū)羊場(chǎng)采集的共250份糞樣進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，糞便鏡檢法共檢出陽(yáng)性樣本2份，陽(yáng)性率為0.8％。普通PCR方法檢出陽(yáng)性樣本7份，陽(yáng)性率為2.8％。熒光定量PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣本8份，陽(yáng)性檢出率為3.2％，經(jīng)測(cè)序，檢出的陽(yáng)性樣本與目的基因相似性在99％以上，兩種PCR方法靈敏性和特異性均較高。
　　本研究還利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的羊肝片吸蟲硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)為診斷抗原，建立了羊

4、肝片吸蟲感染斑點(diǎn)酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)檢測(cè)方法。研究顯示，重組蛋白大小約30 kDa，各組分的最適反應(yīng)條件為:抗原最適包被量為0.28μg/片，血清最佳工作濃度和工作時(shí)間分別為1∶400和30 min，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度和工作時(shí)間分別為1∶800和45 min，血清和酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)溫度均為37℃，最適封閉液和封閉條件分別為2％BSA-TBS和37℃2 h，最佳顯色時(shí)間30 min。特異性試驗(yàn)顯示該方法與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、細(xì)粒

5、棘球蚴、土耳其斯坦東畢吸蟲陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。該方法靈敏度高、重復(fù)性好。但該Dot-ELISA與大片吸蟲是否存在交叉反應(yīng)需要進(jìn)一步的研究。運(yùn)用該方法對(duì)浙江海寧和桐鄉(xiāng)共200份羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為1.5％，提示浙江海寧和桐鄉(xiāng)對(duì)羊肝片吸蟲感染控制較好。
　　綜上所述，本研究建立的普通PCR具有較好的特異性，并首次建立了基于its-2基因的肝片吸蟲SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法，本研究還應(yīng)用硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶重組蛋