高血糖對缺血-再灌注心肌損傷和GIK心肌保護作用的影響及其機制.pdf

1、眾多大型臨床研究結(jié)果表明急性心肌梗死（AMI）患者合并高血糖（血糖水平≥11.1mM）時死亡率升高，同時血管再通后冠脈微循環(huán)障礙、充血性心力衰竭、心源性休克及猝死等并發(fā)癥的發(fā)生率均較血糖水平正常的AMI患者顯著增加，提示高血糖與AMI患者預后不良密切相關。葡萄糖-胰島素-鉀液（GIK）應用于臨床治療AMI已經(jīng)有40余年的歷史。然而有關GIK是否能降低AMI患者死亡率，幾項大型GIK臨床研究的結(jié)果存在很大分歧。研究分析后發(fā)現(xiàn)，當GIK輸注

2、過程中同時存在高血糖時，GIK不能發(fā)揮降低AMI死亡率的作用。提示高血糖有可能抑制了GIK對缺血心肌的保護作用。 激活3-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B (PI3K/Akt) 信號轉(zhuǎn)導通路從而促進缺血心肌細胞存活，是GIK和胰島素保護缺血/再灌注（I/R）心肌的關鍵機制。然而高糖可通過增加活性氧（ROS）產(chǎn)生，直接或間接地抑制Akt激活。那么，高血糖是否抑制在體I/R心肌PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導，從而削弱GIK保護心肌作用，目前并不

3、清楚。本課題旨在研究急性缺血期高血糖對在體I/R心肌損傷的影響，以及對GIK心肌保護作用的影響，并從信號轉(zhuǎn)導角度探討PI3K/Akt信號分子改變在高血糖致缺血性心肌損傷中的作用，以期初步闡明高血糖加重I/R心肌損傷和削弱GIK保護缺血心肌的機制。 目的: 1. 明確急性缺血期高血糖是否加重在體I/R心肌損傷。 2. 明確高血糖是否抑制GIK對在體I/R心肌的保護作用。 3. 初步探討高血糖損傷缺血心

4、肌以及抑制GIK心肌保護作用的機制。 方法: 1. 雄性SD大鼠，腹腔麻醉后，開胸選擇性結(jié)扎冠狀動脈左室支，制備心肌缺血/再灌注大鼠模型。缺血30 min，再灌注4 h或6 h，再灌注開始后封閉胸腔，恢復動物自主呼吸。 2. 微導管自右側(cè)頸動脈插管至左心室，記錄左室內(nèi)壓。分離股動脈并插管記錄動脈壓，分離頸靜脈建立靜脈通路。I/R術中通過八道生理記錄儀持續(xù)記錄大鼠心電圖、心率、動脈壓以及左室內(nèi)壓等血流動力學指標

5、。 3. 在心肌I/R模型的基礎上，經(jīng)靜脈輸注高糖溶液建立缺血期急性高血糖大鼠模型。將SD大鼠隨機分為8組，分別是：(1) 假手術組；(2)生理鹽水對照組；(3) 高糖1組（HG1組）； (4) 高糖2組（HG2組）；(5) GIK組； (6) GIK＋HG組； (7) GIK ＋渥曼青霉素（wortmannin）組；(8) GIK＋ HG ＋wortmannin組。 4. 分別于缺血前、缺血30 min、再灌注2

6、h和4 h由尾靜脈取血，測血糖水平和血胰島素水平。血糖檢測應用葡萄糖氧化酶法，血漿胰島素應用放免法測定。5. 再灌注4h后由頸動脈取血2 ml，用分光光度法檢測血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）活性。 6. 再灌注6h結(jié)束后，采用伊文藍－TTC雙染法測定心肌梗死范圍（IS），IS以心臟梗死范圍(INF) 占缺血區(qū)面積(AAR) 的百分比表示（INF/ AAR ×100％）。 7. 再灌4 h結(jié)束后，取缺血區(qū)心

7、肌組織，采用DAPI細胞核標記和末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP原位平端標記法（TUNEL）復染定性和定量檢測心肌細胞凋亡指數(shù)（AI）。AI以TUNEL陽性細胞數(shù)占總細胞計數(shù)的百分比表示。 8. 采用Western Blot方法測定缺血心肌組織Akt，pAkt，GSK-3β，pGSK-3β蛋白含量，以檢測Akt磷酸化水平及其活性。 結(jié)果: 1. 大鼠血糖水平和血漿胰島素水平在心肌I/R過程中無顯著變化。當經(jīng)

8、靜脈輸注高糖溶液時血糖水平和胰島素水平均顯著升高，建立了AMI合并急性高血糖動物模型。當再灌注期靜脈輸注GIK時，血漿胰島素水平顯著升高。 2. 與對照組相比，HG組再灌注2h和4h的左室內(nèi)壓力變化微分（±LVdP/dtmax）顯著下降，而在GIK組顯著升高。與GIK組相比，GIK＋HG組再灌注4h的±LVdP/dtmax分別下降了11.4 ％ 和10.1 ％(P < 0.05)。提示缺血期急性高血糖不僅使心肌I/R后心功能惡

9、化，而且阻斷了GIK改善再灌注后心室功能恢復的作用。 3. 各實驗組間總?cè)毖秶ˋAR/LV）無明顯差異。再灌注期給予GIK可顯著減少IS，而缺血期高血糖不僅擴大IS，而且抵消了GIK減輕IS的作用。有趣的是，HG和wortmannin對GIK保護作用的阻斷程度相似。另外，同時給予HG和wortmannin，與單獨應用wortmannin相比較，對GIK心肌保護作用的阻斷程度亦無顯著差異。 4. CK和LDH活性反

10、映心肌損傷程度。二者在GIK組顯著降低，缺血期高血糖不僅顯著增加CK和LDH活性，而且使GIK的心肌保護作用消失，CK和LDH活性分別升高了27.3％ 和25.1％（P < 0.05）。 5. 再灌注期給予GIK發(fā)揮顯著的抗心肌細胞凋亡作用，缺血期高血糖則顯著增加缺血心肌細胞凋亡。HG和wortmannin均可阻斷GIK抗細胞凋亡作用，且阻斷程度二者之間不存在差異。更重要的是，同時給予HG和wortmannin，HG并不進一步

11、加重wortmannin對GIK抗心肌細胞凋亡作用的阻斷程度，提示高血糖可能通過阻斷GIK誘導的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑的激活而阻斷GIK的抗細胞凋亡作用。 6. GIK使缺血心肌的pAkt增加1.7倍，pGSK-3β增加2.3倍，而wortmannin幾乎完全阻斷GIK對Akt激活及其心肌保護作用，提示GIK通過PI3K/Akt途徑保護缺血心肌。HG不僅抑制I/R心肌基礎狀態(tài)下的Akt磷酸化及其活性，而且阻斷GIK誘導的

12、Akt活化增加。當同時給予HG和wortmannin時，HG并未進一步加重wortmannin對GIK誘導Akt激活的阻斷程度，提示高血糖阻斷了GIK誘導的PI3K/Akt信號通路激活。 結(jié)論: 1. 缺血期急性高血糖不僅顯著加重大鼠缺血/再灌注心肌損傷，增加缺血心肌對再灌注損傷的敏感性，而且?guī)缀跬耆钄郍IK保護缺血心肌的作用。使心梗面積擴大，心肌酶譜升高，缺血心肌細胞凋亡增加和再灌注后左室功能減低。 2.