長角血蜱絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的原核、真核表達(dá)及其結(jié)構(gòu)的預(yù)測.pdf

1、長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我國流行最廣泛和最重要的蜱種之一，主要叮咬牛、羊以及多種脊椎動物，是病毒、立克次氏體、螺旋體、細(xì)菌、原蟲、支原體、以及衣原體等多種病原重要的傳播媒介，主要影響家畜的生產(chǎn)性能，為畜牧業(yè)的發(fā)展造成極為嚴(yán)重的危害。在眾多蜱的防控方法中，免疫學(xué)防制是前景最誘人的方法之一。 絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitor，serpin)是一類絲氨酸

2、蛋白酶活性調(diào)節(jié)劑，參與血凝、纖維蛋白溶解、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)及腫瘤抑制過程。廣泛存在于動物、植物、病毒和細(xì)菌等各種生物中。蜱中的serpin與血液凝固、細(xì)胞因子激活等相關(guān)的宿主防御反應(yīng)有關(guān)，用蜱的絲氨酸蛋白酶及其抑制劑免疫宿主，能明顯地削弱蜱傳播病原的能力，而長角血蜱中的絲氨酸蛋白酶抑制劑存在于血淋巴中，研究證明是一種“隱藏抗原”，是抗蜱疫苗候選抗原分子。同時該基因具有抗纖維蛋白酶活性，可能與血淋巴內(nèi)的血液凝固調(diào)節(jié)有關(guān)。 本研究

3、根據(jù)GenBank中長角血蜱絲氨酸蛋白酶抑制劑(Haemaphysalis longicornis serine proteinase inhibitor-2，HLS2)基因序列設(shè)計特異性引物，以長角血蜱饑餓成蜱總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出1164 bp的HLS2 DNA片段。將其與pET-30a載體連接，構(gòu)建pET-30a-HLS2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E coli JM109大腸桿菌，篩選陽性克隆，經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析后轉(zhuǎn)化到E

4、coli BL21(DE3)表達(dá)菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。優(yōu)化表達(dá)條件并大量表達(dá)后純化融合蛋白，用Western blouing鑒定其抗原性。結(jié)果表明：獲得的HLS2 DNlA片段與GenBank中的HLS2(序列號ABl62827)序列的同源性為98％；構(gòu)建的pET-30a-HLS2表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)了大小約為47KDa的HLS2融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，IPTG終濃度為1.0

5、mmol/L、28℃誘導(dǎo)7h后融合蛋白的表達(dá)量最高；Westem blotting顯示該融合蛋白可與兔抗長角血蜱陽性血清反應(yīng)。 將前述擴(kuò)增獲得到長角血蜱HLS2基因，與酵母表達(dá)載體pPIC9k.連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9K-HLS2，用Sal I內(nèi)切酶線性化后采用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD平板上挑取重組克隆，經(jīng)G418抗性篩選重組菌株，并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blouing對培養(yǎng)

6、物上清進(jìn)行分析。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了HLS2畢赤酵母真核表達(dá)載體pPIC9K-HLS2；經(jīng)G418抗性梯度篩選獲得了高拷貝菌株；電泳分析表明，培養(yǎng)上清中出現(xiàn)了與預(yù)測分子大小一致的49KDa左右的目的蛋白，且具有良好的免疫活性。本研究獲得的大量HLS2蛋白，解決了抗蜱疫苗的抗原來源問題，為抗長角血蜱疫苗的深入研究奠定了基礎(chǔ)。運用DNAStar分子生物學(xué)軟件，對HLS2蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其抗原表位進(jìn)行了識別分析和預(yù)測，結(jié)果表明HLS2編碼蛋白