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文檔簡(jiǎn)介
1、本文對(duì)口服長(zhǎng)效促胰島素激素在畢赤酵母和大腸桿菌中的表達(dá)、檢測(cè)及其藥理學(xué)活性進(jìn)行了分析。本研究通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)消除了天然GLP-1基因內(nèi)的DPP-Ⅳ和胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，rolGLP-1在血液中能夠免受DPP-Ⅳ的降解，而且在腸道中也能抵抗胰蛋白酶的酶解，為其口服和注射制劑的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將rolGLP-1基因片段多重正向串聯(lián)重復(fù)，將EcoRV和SmaI雙酶切獲得rolGLP-1基因片段利用同尾酶的特性將
2、其克隆到克隆載體pMDGLP-A上，篩選正向連接的轉(zhuǎn)化子，獲得克隆載體pMDGLP-B(2×GLP)，2×GLP表示兩個(gè)rolGLP-1基因正向串連重復(fù)的融合基因，反復(fù)多次可以獲得不同rolGLP-1拷貝數(shù)的融合基因，然后將其克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9、pPIC9K上，分別獲得表達(dá)載體pPIC9rolGLP-1、pPIC9KGLP-T(10×GLP)、pPIC9KGLP-U(14×GLP)和pPIC9KGLP-V(18×GLP)。
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