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文檔簡介
1、[目的]
對清潔級(Specific pathogen Free,SPF)BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide CY)復(fù)制出免疫抑制(immunocompromised host,ICH)模型后,通過對比霧化吸入不同濃度的煙曲霉菌孢子懸液(aspergilosis fumigatus spore,Afs)來構(gòu)建侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,I
2、PA)模型,檢測TLR2(Toll like receptor2,TLR2)、TLR4(Toll like receptor4,TLR4)的表達,探討其在IPA中的作用機制。
[方法]
75只SPF級6-8周齡雌性BALB/c小鼠,體重18-22克,隨機分成5組,分別為A空白對照組、B免疫抑制高濃度Afs模型組,C高濃度Afs正常感染組,D免疫抑制低濃度Afs模型組,E低濃度Afs正常感染組。根據(jù)羅[43]的
3、方法,首先對模型組注射CY復(fù)制ICH模型。Afs高濃度和Afs低濃度組,分別用霧化器霧化108cfu·ml-1、109cfu·ml-1兩種濃度的孢子懸液12ml,空白組以滅菌PBS代替孢子懸液。分別于感染后第1、3、5天眼球取血處死小鼠,并收集標(biāo)本。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測肺泡灌洗液(BALF)中干擾素-γ(IFN-γ)的含量;以熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測各組小鼠肺組織中的IFN-γmRNA的表達;肺組織
4、病理標(biāo)本行蘇木素-伊紅(HE)染色、糖原染色(PAS)染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變;以RT-PCR檢測各組小鼠肺組織中TLR2mRNA、TLR4mRNA的表達,免疫組織化學(xué)(IH)法檢測各組小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白的表達。
[結(jié)果]
1小鼠外周血淋巴細胞計數(shù)的變化對注射CY后的小鼠,取尾靜脈血后,用白細胞計數(shù)液(2%乙酸溶液)進行淋巴細胞計數(shù),與正常組對比,注射第2天的淋巴細胞數(shù)量降低顯著(P<
5、0.05)。
2 ICH、IPA小鼠的反應(yīng)性觀察對小鼠腹腔注射200mg·kg-1CY,連續(xù)注射2天,體毛蓬松凌亂,缺少光澤。小鼠較萎靡,反應(yīng)遲鈍,活動明顯減少。ICH小鼠經(jīng)高濃度Afs感染后表現(xiàn)為萎靡少動,食欲差,呼吸急促,口周圍出血嚴(yán)重、煩躁不安和腹肌抽搐甚至死亡等癥狀,不同劑量組小鼠死亡率差異均有顯著性(P<0.05)。
3 BALF中IFN-γ的含量測定及肺組織中IFN-γmRNA表達與A組對比,B組
6、BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第5天的表達量降低顯著(P<0.05)。與A組對比,C組BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第3天,第5天增加顯著(P<0.05)(P<0.05)。與A組對比,D組BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第3天增加顯著(P<0.05)。與A組對比,E組BALF中的IFN-γ與肺組織中IFN-γmRNA含量在第1天有顯著的增加(P<0.05)4肺組
7、織病理改變第3天時,B組小鼠肺組織可見肺膿腫,可見到孢子;第5天時肺內(nèi)有孢子聚積,可見到菌絲,以及較嚴(yán)重的出血和充血,肺泡間隔增寬,氣管上皮細胞脫落壞死。C組小鼠肺組織可見充血,肺泡彈性纖維被破壞,炎癥和出血,未見有孢子菌絲。
5 IH檢測肺組織TLR2、TLR4蛋白的表達B組TLR2呈強陽性表達;A組為陰性表達,與A對比,B組著色的氣管上皮細胞陽性表達率顯著增加;C組TLR2陽性表達率低于B組;B、C組TLR4均呈陽性表
8、達,C組陽性表達率高于B組。
6小鼠肺組織TLR2mRNA、TLR4mRNA含量的表達與A組對比,B組肺組織中TLR2mRNA表達顯著增加(P<0.05):TLR2的表達量隨著感染時間的增加而增加;C組TLR2mRNA第1天表達增加,第3天增加顯著(P<0.05),第5天表達量降低,沒有顯著差異(P>0.05);與A組對比,B組、C組TLR4mRNA表達量均增加(P<0.05)(P<0.05),C組TLR4mRNA的表達量
9、高于B組(P<0.05)。
[結(jié)論]
1對ICH小鼠霧化Afs能成功誘導(dǎo)BALB/C小鼠IPA模型,Afs高濃度(109cfu·ml-1)能建立具有典型病理特征的穩(wěn)定的IPA模型;
2 IPA模型組在第3天就能出現(xiàn)肺部炎癥的表現(xiàn),并有孢子生成,在第5天時炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重,出現(xiàn)肺膿腫,肺出血、充血,并能見到菌絲。
3在成功建立肺曲霉菌病模型的基礎(chǔ)上,檢測TLR2和TLR4的表達??瞻讓?/p>
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