產(chǎn)γ-聚谷氨酸的地衣芽孢桿菌菌株選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化和產(chǎn)物分離.pdf

1、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種由微生物發(fā)酵合成的氨基酸聚合物，是由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基間的酰胺鍵連接而成。γ-PGA具有極強(qiáng)的水溶性、生物可降解性和生物相容性。γ-PGA及其衍生物在醫(yī)藥、化妝品及日化用品、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。本文以地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CICC10099為出發(fā)菌株，通過誘變育種，篩選得到一株高產(chǎn)突變菌Bacilluslicheniform

2、isS16，對其液體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并在3.7L發(fā)酵罐中進(jìn)行了分批發(fā)酵研究，最后對發(fā)酵液中的γ-PGA進(jìn)行了分離純化。 利用60Coγ射線對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變育種，并對誘變劑量進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)誘變劑量200Gy時，致死率大于90％，正突變率高達(dá)13.3％，200Gy為適宜的誘變劑量。誘變后經(jīng)連續(xù)兩次篩選復(fù)篩，并結(jié)合遺傳穩(wěn)定性分析，篩選出高產(chǎn)突變株BacilluslicheniformisS16，γ-PGA產(chǎn)量16.9g·L-1，

3、比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高72.4％。 采用單因素實驗確定了影響菌株發(fā)酵合成γ-PGA的各因素的參考范圍。用Plackett-Burman法對眾多因素的效應(yīng)進(jìn)行評價并篩選出了有顯著正效應(yīng)的甘油濃度和MnSO4·H2O濃度以及和有顯著負(fù)效應(yīng)的K2HPO4濃度和裝液量等四個因素。由中心組合實驗及響應(yīng)面分析確定了主要影響因素的較佳條件。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，γ-PGA液體發(fā)酵濃度提高到19.23g·L-1。 在3.7L發(fā)酵罐中對分批發(fā)

4、酵生產(chǎn)γ-PGA進(jìn)行了初步研究。當(dāng)裝液量為2升，攪拌轉(zhuǎn)速500r·min-1，通氣量1.10VVM，培養(yǎng)基初始pH=7.5?？刂苝H=6.5發(fā)酵，菌體生物量和γ-PGA產(chǎn)量均有所增加，80hγ-PGA產(chǎn)量可達(dá)23.49g·L-1。對γ-PGA分離純化進(jìn)行了研究。確定分離純化路線：發(fā)酵液→調(diào)pH至3.0,→8000r·min-1離心10min→發(fā)酵液上清液→3倍乙醇沉淀過夜，→8000r·min-1離心10min→沉淀物乙醇洗滌，溶解在蒸

5、餾水中→調(diào)pH至3.0，去離子水中透析過夜→透析液→3倍乙醇沉淀過夜，→8000r·min-1離心10min→沉淀物甲醇洗凈后，→40℃減壓干燥2天→γ-PGA淺黃色粉末γ-PGA樣品在6mol·L-1的HCI，110℃下，酸解36小時后水解完全。用水解液進(jìn)行紙層析，只得到相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品L-谷氨酸鈉的斑點。利用高效液相法測定水解液中的L-谷氨酸鈉含量，最終計算得到γ-PGA樣品的純度為95.7％。純化的γ-PGA樣品在228nm處有吸收峰