干擾素a、恩替卡韋和胸腺肽a1對慢性乙肝患者樹突狀細(xì)胞功能的體外影響.pdf

1、背景和目的 乙型肝炎病毒(hepatitis B vires，HBV)感染是一全球性的公共健康問題，我國是乙型肝炎高流行國家。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者往往遷延不愈，常由肝炎發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，在此過程中機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。研究證明，乙肝慢性化的重要機(jī)制之一是HBV抗原特異性T細(xì)胞免疫耐受，患者不能產(chǎn)生針對HBV特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxJc T lymphocyt

2、e，CTL)免疫反應(yīng)，所以不能清除體內(nèi)病毒。造成CHB免疫耐受的重要原因之一是患者體內(nèi)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)缺陷，不能把病毒抗原的信號有效傳遞給機(jī)體免疫系統(tǒng)。因此，恢復(fù)DC數(shù)量或加強(qiáng)DC抗原遞呈功能，充分激活機(jī)體免疫反應(yīng)已成為治療CHB的重要途徑之一。 DC是能激活初始化T淋巴細(xì)胞的重要抗原遞呈細(xì)胞，在抗病毒細(xì)胞免疫中起重要作用。通過粒細(xì)胞．巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4

3、)體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增可以獲得足夠的外周血單核細(xì)胞來源DC(monocyte-derived DC，MoDC)。CD1a主要表達(dá)于人胸腺細(xì)胞和DC，是人DC相對特征性標(biāo)志，CD83是成熟DC的重要標(biāo)記，CD80、HLA-DR是其表面重要的共刺激分子。 干擾素α(interferon-α，IFN-α)和核苷(酸)類似物是目前國內(nèi)外公認(rèn)的慢性乙肝抗病毒治療藥。IFN-α除直接抑制HBV復(fù)制外，通過增強(qiáng)機(jī)體對}tBV的免疫力也是一重要的途徑

4、，其機(jī)制較復(fù)雜；恩替卡韋(entecavir，ETV)是一新型口服核苷類藥物，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)磷酸化后，與脫氧胞嘧啶核苷(dCTP)競爭進(jìn)入病毒合成中的DNA鏈，終止病毒DNA的復(fù)制。胸腺肽α1可增強(qiáng)非特異性免疫功能，多用于聯(lián)合治療CHB。但這些藥物對于CHB患者DC的影響，文獻(xiàn)報道較少，尤其是ETV作為目前臨床上最強(qiáng)的CHB抗病毒藥，對于機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響未見報道。本研究以IFN-α、ETV和胸腺肽α1分別與CHB的外周血MoDC體外共孵育

5、，通過測定DC表面CD1a、CD83、CD80、HLA-DR等表型分子的表達(dá)，檢測DC培養(yǎng)液中IL-6、IL-12含量和同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等一系列指標(biāo)觀察它們對CHB的DC生物學(xué)特性的影響，為臨床上應(yīng)用以上藥物及其與DC疫苗相結(jié)合治療CHB尋找實驗依據(jù)。 材料與方法 采集CHB患者及健康人外周新鮮靜脈血以肝素抗凝后通過淋巴細(xì)胞分離液體外密度梯度離心分離獲得單個核細(xì)胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸

6、單個核細(xì)胞后接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板靜置2小時，輕輕洗脫未貼壁懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10ng/ml rhGM-CSF和5ng/mlrhIL-4)誘導(dǎo)擴(kuò)增，37℃、5％CO<,2>飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天半量換液。第5天收集DC，將CHB來源DC分別加入一定濃度的IFN-α(300U/ml)、胸腺肽α1(0.1μg/ml)和ETV(0.05μg/ml)分為IFN-α組、胸腺肽α1組、E

7、TV組和IFN-α+胸腺肽α1組，同時設(shè)健康對照組和CHB對照組，繼續(xù)共培養(yǎng)，第8天收獲各組DC進(jìn)行以下相關(guān)檢測： 1.倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 2.流式細(xì)胞儀(FCM)測定DC表型分子CD1a、CD83、CD80及HLA-DR的表達(dá)。 3.同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)法測定DC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力。 4.ELISA法檢測DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-6含量。 結(jié)果 1.培養(yǎng)第8d

8、觀察各組細(xì)胞，健康對照組培養(yǎng)液中漂浮著較多云霧狀的DC細(xì)胞團(tuán)，表面突起豐富；各藥物處理組均可見表面突起豐富的DC；CHB對照組DC多呈不規(guī)則形、多角形；健康對照組和各CHB藥物處理組細(xì)胞分化形態(tài)優(yōu)于CHB對照組。 2.培養(yǎng)第8d的各組DC表型分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表達(dá)，在健康對照組明顯高于CHB對照組和各CHB藥物處理組(P<0.05)；CHB對照組低于各CHB藥物處理組(P<0.05)；IFN-α+胸腺肽α1

9、組、IFN-α組和胸腺肽α1組無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)，但均高于ETV組(P<0.05)。 3.健康對照組DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)；CHB對照組DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力最弱；各CHB藥物處理組強(qiáng)于CHB對照組；IFN-α+胸腺肽α1組、IFN-α組和胸腺肽α1組無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)，但均高于ETV組(.P<0.05)。 4.各組DC培養(yǎng)上清液中IL-12含量為健康對照組最高，其次為各C

10、HB藥物處理組，CHB對照組最低(P<0.05)；IL-6含量與之相反(P<0.05)。 結(jié)論 1.采用rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)的方法可以成功地從外周血單核細(xì)胞中體外誘導(dǎo)分化成DC，為進(jìn)一步實驗研究提供足量的細(xì)胞。 2.CHB的DC與健康人相比其分化較差，膜表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR表達(dá)降低，刺激淋巴細(xì)胞增殖能力及分泌IL-12的能力低下，提示其功能缺陷，可能是HBV慢性感染