紅花水提物的抗氧化作用及ESR波譜研究.pdf

1、氧化-抗氧化平衡是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本內(nèi)涵之一,生物體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等,這些抗氧化物質(zhì)不斷清除產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基,以保持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡；一旦氧自由基產(chǎn)生超過(guò)清除,一些重要的酶的功能就會(huì)被破壞,出現(xiàn)氧化應(yīng)激,引起細(xì)胞膜多價(jià)不飽和脂肪過(guò)氧化反應(yīng)。因自由基氧化應(yīng)激而損傷生物分子包括蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過(guò)氧化等,涉及人類(lèi)一些疾病的病因?qū)W及病理過(guò)程,神

2、經(jīng)系統(tǒng),早老性癡呆癥,震顫麻痹癥,癲癇等疾病都有氧自由基的參與；在循環(huán)系統(tǒng),動(dòng)脈粥樣硬化,血栓的形成,心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程中氧自由基也起著重要作用；肝炎和糖尿病與氧自由基密切相關(guān)；致癌、促癌和癌的形成的每一步都有氧自由基的產(chǎn)生與參與；白內(nèi)障的形成和視網(wǎng)膜的損傷是氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的直接結(jié)果；在免疫反應(yīng)的炎癥中,巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)釋放大量氧自由基等。其中典型的例子是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)氧化修飾導(dǎo)致的AS發(fā)生發(fā)展。ox-

3、LDL能夠誘發(fā)氧自由基的產(chǎn)生,生成脂過(guò)氧自由基,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的連鎖反應(yīng),進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能,使其通透性增高,加速AS的形成；心肌缺血再灌注損傷近年來(lái)受到人們廣泛的關(guān)注,其氧自由基產(chǎn)生過(guò)多是其發(fā)生機(jī)制之一；過(guò)氧化氫(H2O2)是機(jī)體氧化代謝產(chǎn)物,同時(shí)又是一種活性氧,很容易穿透細(xì)胞膜到達(dá)胞內(nèi)位點(diǎn),生成·OH等活性更強(qiáng)的自由基,引起一系列的損傷,采用過(guò)氧化氫損傷模型可模擬多種氧自由基引發(fā)疾病的病理狀態(tài)。
　　 氧自由基損傷與

4、人類(lèi)的100多種疾病有直接關(guān)系,因此,預(yù)防或減少體內(nèi)的氧自由基損傷,從而減少疾病的發(fā)生是人們一直期待解決的問(wèn)題。本研究作為科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(十一五科技計(jì)劃):抗氧化中藥功效及安全性評(píng)價(jià)技術(shù)體系的建立的子課題,通過(guò)文獻(xiàn)查閱及前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),紅花作為活血化瘀的常用中藥,具有多方面的藥理作用,在防治心血管疾病方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此,本項(xiàng)研究從體內(nèi)和體外兩個(gè)層次,以抗氧化為切入點(diǎn),采用不同的氧化病理?yè)p傷模型,觀察紅花水提物抗氧化作用及其

5、機(jī)制,為紅花的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 本研究采用整體大鼠高脂血癥模型、體外ox-LDL致心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型、心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再給氧損傷模型、乳鼠心肌細(xì)胞缺氧再給氧損傷模型、乳鼠心肌細(xì)胞H2O2損傷模型,觀察紅花水提物的抗氧化作用和作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.紅花水提物對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化作用的影響
　　 喂飼高脂飼料建立高脂血癥大鼠模型,觀察紅花水提物對(duì)高脂血癥大鼠的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)共分

6、5組:空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,紅花水提物組(4.05,2.03,0.81 g生藥·kg-1)劑量組,連續(xù)給藥4周后,測(cè)定血清MDA,SOD和NO水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:給予紅花水提物三個(gè)劑量后可明顯降低高脂血癥大鼠血清MDA的含量,中劑量能提高血清SOD活性,提示紅花水提物對(duì)高脂血癥大鼠具有一定程度的抗氧化作用。
　　 2.紅花水提物對(duì)ox-LDI所致心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響
　　 采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,

7、觀察紅花水提物預(yù)處理對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)損傷的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分5組,空白對(duì)照組:正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對(duì)照組:加入ox-LDL(100μg·mL-1)孵育24 h；紅花水提物500,100,20μg·mL-1劑量組:分別加入不同濃度的紅花水提物預(yù)處理24 h,然后換為100μg·mL-1的ox-LDL溶液孵育24 h。所有細(xì)胞均在37℃,95％O2+5％CO2,飽和濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收集

8、細(xì)胞上清液測(cè)定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集細(xì)胞懸液應(yīng)用電子自旋波譜儀測(cè)定活性氧自由基信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:紅花水提物預(yù)處理能明顯提高ox-LDL損傷的內(nèi)皮細(xì)胞存活率,減少LDH,MDA和XOD釋放量,提高SOD,GSH-Px和NOS活性,同時(shí)使細(xì)胞懸液中的自由基信號(hào)明顯減弱。結(jié)果提示紅花水提物對(duì)ox-LDL損傷的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與直接減少自由基生成,增強(qiáng)其清除以及增強(qiáng)內(nèi)源性

9、抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 3.紅花水提物對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所致?lián)p傷的影響
　　 分別采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞和原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞,建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,觀察紅花水提物預(yù)處理對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)各分5組,空白對(duì)照組:正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對(duì)照組:缺氧3h/復(fù)氧1h；紅花水提物500,100,20μg·mL-1劑量組:分別給予不同濃度的紅花水提物預(yù)

10、處理24h后,缺氧3h/復(fù)氧1h。除缺氧外,所有細(xì)胞均在37℃,95％O2+5％CO2,飽和濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收集細(xì)胞上清液測(cè)定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集細(xì)胞懸液應(yīng)用電子自旋波譜儀測(cè)定活性氧自由基信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:紅花水提物預(yù)處理能明顯提高缺氧3h/復(fù)氧1h后細(xì)胞存活率,減少LDH,MDA釋放,降低XOD活力,提高SOD,NO和NOS活性,同時(shí)使細(xì)胞懸液中的活性氧

11、自由基信號(hào)明顯減弱。結(jié)果提示紅花水提物對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與直接減少自由基生成,增強(qiáng)其清除以及增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 4.紅花水提物對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞H2O2所致氧化損傷的影響
　　 采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞,建立心肌細(xì)胞H2O2氧化損傷模型,觀察紅花水提物預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞H2O2氧化損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分5組,空白對(duì)照組:正常普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對(duì)照組

12、:換為H2O2(1 mmol·L-1)孵育1h；紅花水提物500,100,20μg·mL-1劑量組:分別給予不同濃度的紅花水提物,預(yù)處理24h,然后換為H2O2(1mmol·L-1)孵育1h。所有細(xì)胞均在37℃,95％O2+5％CO2,飽和濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收集細(xì)胞上清液測(cè)定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集細(xì)胞懸液應(yīng)用電子自旋波譜儀測(cè)定活性氧自由基信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:紅花

13、水提物三個(gè)劑量組預(yù)處理能明顯提高H2O2氧化損傷的心肌細(xì)胞存活率,減少LDH,MDA和XOD含量,提高SOD,GSH-Px和NO活性,同時(shí)有使細(xì)胞懸液中的自由基信號(hào)減弱的趨勢(shì)。結(jié)果提示紅花水提物對(duì)心肌細(xì)胞H2O2氧化損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與直接減少自由基生成,增強(qiáng)其清除以及增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 綜上,紅花水提物預(yù)處理不僅在整體動(dòng)物模型,對(duì)高脂血癥大鼠具有一定的抗氧化作用,在體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞ox-LD