sigE、sigK和spoⅢAE對蘇云金芽胞桿菌cry基因表達的影響.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點而成為應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物。Bt與其它芽胞桿菌相比，一個顯著特點就是不僅能夠形成芽胞，同時還能產(chǎn)生由殺蟲蛋白組成的晶體。在模式芽胞桿菌一枯草桿菌中有關(guān)芽胞形成的相關(guān)基因研究較深入，Bt晶體形成機制方面的研究主要集中在殺蟲晶體蛋白基因的表達調(diào)控，而晶體形成又與芽胞形成特異性基因有關(guān)。在芽胞桿菌的模式菌-枯草芽胞桿菌芽胞形成的級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，SigE和SigK因子是芽胞桿菌芽胞形成過

2、程中起重要作用的sigma因子，控制著眾多芽胞形成相關(guān)基因的表達。在蘇云金芽胞桿菌中，Cry1等殺蟲晶體蛋白的表達也受SigE因子和SigK因子的控制。spoⅢAE基因的轉(zhuǎn)錄由上游的SigE因子控制，SpoⅢAE蛋白則是激活下游的SigK因子所必需的，研究表明spoⅢAE基因的缺失也影響芽胞晶體的形成。 本研究的sigE和sigK部分主要以蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種標準菌株HD-73為材料，構(gòu)建了sigE和sigK基因的敲除載體

3、pMADE和pRNK，導(dǎo)入HD-73菌株，利用同源重組技術(shù)通過高溫誘導(dǎo)分別敲除了其中的sigE和sigK基因，獲得了sigE和sigK單基因缺失突變株HD-73(ΔsigE)和HD-73(ΔsigK)。研究結(jié)果表明：突變對菌株生長影響較大，衰亡期提前，喪失了形成芽胞和晶體的能力；以crylAa基因啟動子表達β-半乳糖苷酶，酶活性顯著降低，說明sigE和sigK基因?qū)ry1Aa基因啟動子活性具有較大影響。以sigE直接調(diào)控的spoⅡD基

4、因啟動子表達β-半乳糖苷酶，分析表明突變株中spoⅡD基因的活性菌顯著降低。隨后，以sigE所在操縱子spoⅡG的啟動子表達β-半乳糖苷酶，結(jié)果表明突變株HD-73(ΔsigK)中sigE基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。這說明sigK基因的敲除嚴重降低了SigE因子的活性。利用表達載體pHT315對突變株進行恢復(fù)，pHT315攜帶sigE所在操縱子spoⅡG及其啟動子序列在突變株HD-73(ΔsigE)中表達，使突變株恢復(fù)了產(chǎn)生芽胞和形成殺蟲晶

5、體的能力，生長基本恢復(fù)正常。pHT315攜帶sigK及其啟動子序列在突變株HD-73(ΔsigK)中表達，沒有能使該基因功能恢復(fù)，再導(dǎo)入另一種抗性的spoⅡG表達載體后仍然沒有得到能夠產(chǎn)生芽胞和形成殺蟲晶體的恢復(fù)株。這些結(jié)果表明在Bt庫斯塔克亞種中，SigE和SigK因子是菌株產(chǎn)生芽胞和形成晶體所必需的，并且兩者之間存在一種復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。spoⅢAE基因的缺失對sigE基因的轉(zhuǎn)錄水平影響的研究以蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種G03為材料。

6、sigE啟動子指導(dǎo)的β-半乳糖苷酶活性分析表明，突變株G03(ΔspoⅢAE)中sigE基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。這說明spoⅢAE基因的敲除嚴重降低了pre-SigE因子的轉(zhuǎn)錄。在枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis，簡稱Bs)168的spoⅢAE基因的缺失突變株中，spoⅡD和sigE的啟動子指導(dǎo)的β-半乳糖苷酶活性均沒有降低，這說明spoⅢAE基因的敲除沒有影響pre-SigE因子的轉(zhuǎn)錄。這表明，在Bt和Bs中，spoⅢA

7、E基因?qū)re-SigE因子轉(zhuǎn)錄的影響存在差異。sigE、sigK和spoⅢAE基因在芽胞桿菌芽胞形成過程中起著重要的作用，而其中sigE和sigK基因編碼芽胞形成重要的調(diào)節(jié)因子SigE和sigK因子，兩基因缺失突變株的獲得為今后利用基因芯片表達譜分析技術(shù)、解析SigE和SigK因子調(diào)控的基因數(shù)目，揭示殺蟲晶體蛋白的表達調(diào)控、晶體形成機制及其與芽胞形成的關(guān)系提供了必要的材料，具有重要的理論意義；并能夠進一步揭示更多在Bt和Bs中表達存在