擬穴青蟹兩種抗菌肽Scygonadin2和Sphistin的抗菌活性及其與抗生素的協(xié)同抗菌作用.pdf

1、抗生素(antibiotics)作為最廣泛應(yīng)用的抗細(xì)菌藥物，目前被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，但超量、濫用抗生素造成了水產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)等一系列問題，如何控制抗生素的過量應(yīng)用是亟待解決的重要科學(xué)與生產(chǎn)問題，因此尋找抗生素的有效替代品是目前國內(nèi)外本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫中的重要免疫活性因子，具有廣譜的抗菌性，且不會產(chǎn)生耐藥性，在所有替代抗生素的選擇中，抗菌肽被認(rèn)為是普遍存在于各種生

2、物中由基因編碼的“天然抗生素”，是抗生素的最佳替代品之一，具有廣闊的應(yīng)用前景?？股厥瞧駷橹挂阎膶Ω鞣N病原微生物抑殺效果最有效的化學(xué)合成物質(zhì)，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種活性物質(zhì)能夠完全替代抗生素，因此在實(shí)際生產(chǎn)中采取降低抗生素的用量，從而使水產(chǎn)品中抗生素的殘留量符合國內(nèi)外安全標(biāo)準(zhǔn)，也是解決抗生素污染的重要途徑。本研究利用體外合成的抗菌肽Sphistin和基因工程表達(dá)產(chǎn)物Scygonadin2，通過與3種不同的抗生素聯(lián)合試驗(yàn)，評價(jià)Sphisti

3、n和Scygonadin2與抗生素的協(xié)同抑殺菌效果，為探索抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要研究成果如下:
　　1.Scygonadin2基因在畢赤酵母中的表達(dá)及抗菌活性:構(gòu)建了pPIC9K-Scygonadin2真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中進(jìn)行真核表達(dá)，對表達(dá)獲得的抗菌肽進(jìn)行親和層析純化后，進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，真核表達(dá)的抗菌肽Scygonadin2對革蘭氏陽性菌具有較好的抑殺活性，對被測的革蘭氏陰

4、性菌無抑殺活性(＞50μM)。
　　2.N-末端的組成差異對Scygonadin2的抗菌活性的影響:分別構(gòu)建pPIC9K-Scygonadin2載體和pPIC9K-Kex2-Scygonadin2載體，將載體分別轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中進(jìn)行真核表達(dá)，對表達(dá)獲得的蛋白純化后進(jìn)行N-末端測序，測序結(jié)果表明，由GS115/pPIC9K-Kex2-Scygonadin2的畢赤酵母菌株表達(dá)獲得的抗菌肽，其N-末端與天然蛋白的N-末端氨基酸

5、序列相同，無多余氨基酸。由GS115/pPIC9K-Scygonadin2的畢赤酵母菌株表達(dá)獲得抗菌肽，其N-末端存在限制性酶切位點(diǎn)導(dǎo)致的多余氨基酸殘基Tyr-Val-Glu-Phe。對兩種N-末端組成存在差異的Scygonadin2分別進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種不同N-末端的Scygonadin2對細(xì)菌的抑殺效果基本相同，不存在顯著性差異，表明N-末端的組成差異對Scygonadin2的抗菌活性并未產(chǎn)生顯著性地影響，該實(shí)驗(yàn)為體外表達(dá)具有天

6、然活性的抗菌肽奠定了理論基礎(chǔ)。
　　3.擬穴青蟹陰離子抗菌肽Scygonadin2同抗生素的協(xié)同抗菌效果:將純化后的抗菌肽Scygonadin2同青霉素、鏈霉素和四環(huán)素等抗生素進(jìn)行協(xié)同抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Scygonadin2與四環(huán)素協(xié)同使用時(shí)，對熒光假單胞菌的抑殺存在協(xié)同作用(FICI=0.266)，Scygonadin2與青霉素對施氏假單胞菌的抑殺有增強(qiáng)作用(FICI=0.508)。
　　4.擬穴青蟹陽離子抗菌肽Sphi