gutD基因和SOD2基因植物表達載體構(gòu)建及gutD基因苜蓿轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化.pdf

1、干旱、鹽堿和低溫是自然界普遍存在的抑制植物生長的因素，鹽脅迫下，植物離子均衡受到迫害，尤其是細胞質(zhì)中過多的Na+，對植物的代謝產(chǎn)生毒害。植物細胞為適應脅迫環(huán)境，一方面可積累可溶性有機物質(zhì)；另一方面通過Na+排出或區(qū)隔化，并調(diào)整K+/Na+比率的機制來消除Na+的毒害。許多研究表明山梨醇含有六個羥基，親水性能強，能有效維持細胞內(nèi)的水活度。它不僅僅是生物代謝的中間產(chǎn)物，而且還有許多其它功能，如滲透調(diào)節(jié)、作為相溶性物質(zhì)以降低細胞水勢、碳源和能

2、量的貯存物質(zhì)、調(diào)節(jié)同功酶和消除羥基自由基、還有可能在脅迫條件下穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能或可能是小分子量的分子伴侶等；而SOD2基因在裂殖酵母中是控制Na+外流的基因，在裂殖酵母中編碼排Na+的質(zhì)膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白，在保持裂殖酵母細胞離子均衡上用重要意義。 紫花苜蓿又名紫苜蓿(Medicaosativa)，為豆科多年生草本植物。紫花苜蓿是我國大面積種植的優(yōu)質(zhì)牧草，營養(yǎng)豐富，抗性強。分布于我國西北、東北、華北、及江淮流域等地，是

3、栽培歷史最長、面積最大的重要牧草。具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟利用價值，如能提高抗逆性，對退耕還草、發(fā)展畜牧業(yè)和改善生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義。本研究主要是克隆和構(gòu)建gutD和SOD2基因的植物表達載體，為基因工程育種奠定良好的基礎(chǔ)；同時利用基因槍和農(nóng)桿菌介導的不同方法優(yōu)化苜蓿gutD基因的轉(zhuǎn)化體系。以期獲得抗旱、抗鹽、耐低溫的新品系，擴大種植面積，改善生態(tài)環(huán)境。目前取得的主要研究結(jié)果如下： 1.gutD基因的植物表達載體的構(gòu)建通過RT

4、-PCR的方法從大腸桿菌K12中擴增出了gutD基因的全長cDNA片段，將其克隆到pMD18T-vector中，序列分析表明克隆的片段長度為780bp，包含了完整的gutD基因的編碼序列，除編碼區(qū)第72位密碼子CTT變?yōu)镃CT其它序列與所報道的修正序列一致。以BamH Ⅰ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶從克隆載體上切取gutD基因，將其連接在相應酶切的中間載體KS上，再以KpnⅠ和BamHⅠ酶切重組子獲得具粘性末端的目的片段(gutD)與植物表

5、達載體pCAMBIA2300連接，重組質(zhì)粒通過雙酶切和PCR鑒定正確后，采用直接轉(zhuǎn)化法將pCAMBIA2300-gutD質(zhì)粒導入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，并用PCR方法進行了鑒定。 2.SOD2基因的植物表達載體的構(gòu)建通過RT-PCR的方法從裂殖酵母中擴增出了SOD2基因的全長cDNA片段，將其克隆到pMD18T-vector中，序列分析表明克隆的片段長度為1404bp，包含了完整的SOD2基因的編碼序列，其它序列與所報道的序列

6、完全一致。以XbaⅠ和HindⅢ酶切限制性內(nèi)切酶從克隆載體上切取SOD2基因獲得具粘性末端的目的片段(SOD2)與植物表達載體pCAMBIA2300連接，重組質(zhì)粒通過PCR鑒定正確后，采用直接轉(zhuǎn)化法將pCAMBIA2300-SOD2質(zhì)粒導入根癌農(nóng)桿菌GV3101，并用PCR方法進行了鑒定。 3.gutD基因轉(zhuǎn)化莒蓿的研究利用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導法，將gutD基因轉(zhuǎn)入苜蓿。結(jié)果表明：(1