Ⅱ型豬圓環(huán)病毒ORF2基因的畢赤酵母真核表達載體的構建及其表達.pdf

1、豬圓環(huán)病毒是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，除PMWS之外，與許多豬相關疾病的發(fā)生有關，如豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病，并且這些相關聯(lián)的豬的疾病已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，死亡率10-30％不等。較嚴重的地區(qū)，豬場在暴發(fā)本病時死淘率高達40％左右，其危害和造成的重大經(jīng)濟損失顯而易見，現(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認為本病是繼豬繁殖與呼吸

2、綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的重要的豬傳染病。因此如何防制該病和盡早檢測該病已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)面臨的新問題。 豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無囊膜，二十面體對稱，核酸為共價閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒。研究表明，PCV1和PCV2均含有兩個主要的開放閱讀框，即ORF1和ORF2。其中ORF1編碼病毒的復制相關蛋白(ReP蛋白)，是PCV1、PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要蛋白質(zhì)。ORF2編碼病毒的主要結構蛋白(Cap蛋白)，是PCV

3、1、PCV2的主要保護性抗原，在PCV1與PCV2間不發(fā)生交叉反應，只有PCV20RF2蛋白可以被PCV2多抗識別。因而該蛋白可以作為檢測PCV2抗體的有力診斷工具.畢赤酵母表達系統(tǒng)兼具有原核和真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，不僅容易操作、耗時短、培養(yǎng)基廉價，而且最顯著特點為畢赤酵母易于高密度發(fā)酵，表達水平相當高，另外，酵母細胞具有對表達產(chǎn)物進行類似真核細胞的蛋白加工、折疊和翻譯后修飾等優(yōu)點，而且在分泌表達外源蛋白過程中，畢赤酵母本身幾乎不分泌蛋白

4、，所以雜蛋白少，使表達蛋白利于純化。因而，畢赤酵母為表達重組蛋白提供了一個良好的真核表達環(huán)境，可以使蛋白基因得到高效的表達并且特異性高，從而應用在豬圓環(huán)病毒病的快速診斷當中。 在本研究中，根據(jù)GeneBank中豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV2)序列，設計1對引物，并以提取的包含PCV2全基因組的DNA為模板，擴增出含ORF2基因的片段(675 bp)，回收PCR產(chǎn)物，將其克隆入pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD-ORF2，通過酶切鑒

5、定和PCR鑒定，證實了所克隆的基因與目的基因大小一致。重組質(zhì)粒經(jīng)SnaBⅠ和AvrⅡ雙酶切，回收ORF2基因，與真核表達載體pPIC9K進行連接、轉化、克隆鑒定。然后，通過電轉化法將經(jīng)SalⅠ酶切線性化的pPIC9K-ORF2質(zhì)粒轉化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，利用甲醇誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot免疫印跡分析電泳分析。結果表明成功的獲得了吉林株PCV2病毒的ORF2部分基因，獲得了完整開放閱讀框架，其大小