銀杏胚珠非編碼小RNA的鑒定和分析.pdf

1、素有“活化石”之稱的銀杏（Ginkgo biloba L.），被認(rèn)為是地球上繼蕨類物種之后出現(xiàn)最早的種子植物之一。銀杏起源歷史悠久，其生殖過程表現(xiàn)出獨特的性狀，尤其是雌性生殖器官胚珠的生長與發(fā)育，更是具有許多獨特的原始特征。目前大多數(shù)研究集中在有關(guān)銀杏胚珠的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)、胚珠組織形成和生理生化變化等方面，而有關(guān)調(diào)控銀杏胚珠生長發(fā)育的分子機制方面鮮有報道。MicroRNAs（miRNAs），是一類內(nèi)源性的、單鏈的、長度約為22個核苷酸(n

2、t)的非編碼小RNA，在真核生物中進化具有高度保守性，通過直接對靶基因切割或抑制靶基因翻譯的手段，參與到植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和環(huán)境脅迫響應(yīng)等生命進程的各個方面。因此，對銀杏胚珠開展miRNA的鑒定與功能研究具有重要的意義，可為進一步研究銀杏胚珠生長發(fā)育的分子機理提供有力幫助。
　　本研究中，以銀杏胚珠為實驗材料，采用高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的方法，鑒定和分析了銀杏胚珠的miRNA及其靶基因。取得主要結(jié)果如下:

3、
　　(1)通過測序，從銀杏胚珠中總共得到12，121，385個高質(zhì)量的sRNA序列，去除3'接頭缺失序列、5'接頭污染序列、無插入片段、小于18nt的短序列及Poly A序列等低質(zhì)量序列后，最終得到11，919，364（1，991，395 unique）條干凈序列。
　　(2)對銀杏胚珠小RNA文庫中的clean reads進行分析與分類注釋。文庫中的小RNA長度集中在19-24 nt之間，符合典型miRNA長度分布。通過

4、比對基因組，其中包含核糖體RNA(rRNA)有519，513條序列(31，039 unique)，占到sRNA總數(shù)的4.36％(1.56％ unique);小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）5，769條序列(1，014unique)，占到sRNA的0.05％(0.05％ unique);核仁小RNA(small Nucleolus RNA，snoRNA)1，858條序列(376 unique)，占總數(shù)的0.02

5、％(0.02％ unique);轉(zhuǎn)運RNA(transfer ribonucleicacid，tRNA)203，471條序列(6，636unique)，占總數(shù)的1.71％;未注釋(unannatation)的sRNA8，627，585條序列(1，932，584unique)，占到總數(shù)的72.38％(97.05％ unique)。
　　(3)將胚珠的sRNA序列比對到miRBase數(shù)據(jù)庫（miRBase20.0）中所有植物的miRN

6、A成熟序列以及前體序列，最終比對得到19，746條唯一同源序列，經(jīng)過嚴(yán)格篩選之后，最終鑒定得到保守序列144條，隸屬于35個miRNA家族。
　　(4)將小RNA注釋分析去除各種小RNA序列以后得到的未注釋序列，用來進行新的miRNA預(yù)測。得到新的miRNA種數(shù)為99種，總表達量為132，843。在對新的miRNA進行首位堿基偏向性分析中發(fā)現(xiàn)，銀杏胚珠中19-24nt的首位堿基對堿基U具有偏向性，符合成熟序列首位堿基對堿基U的偏向

7、性要求。
　　(5)應(yīng)用psRNATarget軟件，對銀杏胚珠的miRNA進行靶基因預(yù)測，銀杏胚珠中已知的445個miRNA，預(yù)測得到2，062個靶基因，靶基因位點數(shù)為2，487個;123個新的miRNA，預(yù)測得到靶基因898個，共有靶基因位點數(shù)1，331個。GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶基因的功能參與銀杏胚珠的代謝過程、細(xì)胞進程等生長發(fā)育的各個生命活動進程。
　　(6)對銀杏胚珠的靶基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，大部分靶基因為植物轉(zhuǎn)錄因子

8、，我們從中挑選出具有前體序列，并且與光合作用、代謝合成、抗病以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能相關(guān)的14個已知的miRNA和表達量比較高的11個新的miRNA，應(yīng)用亞克隆技術(shù)，進行前體驗證，最終得到10個miRNA前體與Illumina測序結(jié)果完全匹配，7個低于3個堿基錯配。
　　(7)對銀杏胚珠與銀杏雌株葉片中的miRNA的表達量進行差異分析，發(fā)現(xiàn)已知的miRNA中胚珠相對于雌株葉片有300個上調(diào)，171個下調(diào)，73個無顯著差異;新的miRNA

9、中胚珠相對于雌株葉片有46個上調(diào)，47個下調(diào)，21個無顯著差異。
　　(8)根據(jù)上面靶基因功能以及前體驗證結(jié)果，我們從中一共挑選出19個miRNA前體序列進行熒光定量PCR實驗，以兩個不同時期的銀杏胚珠與銀杏雌株葉片為實驗材料，分析miRNA在同一時期不同組織中以及同一組織不同時期的表達差異性。
　　綜上，本研究通過對銀杏胚珠中miRNA的鑒定與分析，揭示了銀杏胚珠中存在較多數(shù)量的小RNA，并且這些小RNA參與到了銀杏的生長