遺傳性白內(nèi)障和原發(fā)性小頭畸型致病基因的鑒定.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科為我們提供了三個(gè)常染色體顯性遺傳性白內(nèi)障家系的資料.我們對(duì)這三個(gè)家系的白內(nèi)障臨床分型進(jìn)行了描述,在裂隙燈下對(duì)患者晶狀體進(jìn)行仔細(xì)的檢查后,根據(jù)白內(nèi)障發(fā)生的部位及混濁的形態(tài)進(jìn)行了臨床分型,分別為:先天性板層狀白內(nèi)障家系1個(gè)、先天性核性白內(nèi)障家系1個(gè)、先天性進(jìn)行性粉塵狀白內(nèi)障家系1個(gè).為了進(jìn)行致病基因定位,我們選取了晶狀體球蛋白基因、連接蛋白基因和DLAD(DNase Ⅱ-like acid DNase)基因所在的

2、染色體區(qū)域(共8個(gè))作為候選位點(diǎn),與收集到的3個(gè)白內(nèi)障家系分別進(jìn)行了連鎖分析.這8個(gè)位點(diǎn)是:1p22.3、1q21-q25、2q33-q35、11q21.1-q23.2、13q11、17q11-q12、21q22.3和22q11.2-q12.1.在這些區(qū)域選擇短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)多態(tài)標(biāo)記,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后,對(duì)等位片段進(jìn)行分析,構(gòu)建單體型,并用LINKAGE軟件包中的ML

3、INK軟件對(duì)所采用的STR位點(diǎn)與所研究的白內(nèi)障家系致病位點(diǎn)進(jìn)行兩點(diǎn)連鎖分析.結(jié)果在先天性板層狀白內(nèi)障家系(家系6)中,在染色體2q33-35區(qū)域中的5個(gè)STR多態(tài)標(biāo)記與疾病共分離,其中在D2S2944,當(dāng)θ=0時(shí)獲得了最大的兩點(diǎn)連鎖LOD值2.44.另外,先天性粉塵狀白內(nèi)障家系(家1系4)在D22S315和D1S3466,當(dāng)θ=0時(shí),分別獲得最大的LOD值1.38和1.08,提示家系4不能排除與這兩個(gè)位點(diǎn)的連鎖關(guān)系.在連鎖分析的基礎(chǔ)上,

4、進(jìn)一步在不能排除連鎖關(guān)系的候選位點(diǎn)附近選擇已知的白內(nèi)障致病基因,通過(guò)直接測(cè)序進(jìn)行突變分析.在家系6中,對(duì)候選基因(CRYGA~CRYGD)進(jìn)行了直接測(cè)序,結(jié)果在患者CRYGD基因外顯子3中檢測(cè)到一個(gè)新的475delG缺失突變.PCR擴(kuò)增家系中所有成員的CRYGD外顯子3片段,經(jīng)異源雙鏈分析后,發(fā)現(xiàn)只有患者中出現(xiàn)一條滯后的帶,表明正常個(gè)體無(wú)此突變.這一突變預(yù)計(jì)會(huì)使CRYGD在第158位密碼子后產(chǎn)生移碼突變,編碼一個(gè)165個(gè)氨基酸組成的異常

5、蛋白,而正常蛋白由173個(gè)氨基酸組成,因此突變嚴(yán)重影響了γD-晶狀體球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能.家系4中,對(duì)CRYBB2基因的突變熱點(diǎn)區(qū)和JGA8基因的編碼外顯子進(jìn)行了測(cè)序,都未檢測(cè)到堿基改變.原發(fā)性小頭畸型(microcephaly,MCPH)是一種罕見(jiàn)的大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙性疾病,通常呈現(xiàn)常染色體隱性遺傳.MCPH患者的主要臨床表現(xiàn)為:頭圍低于相同年齡和性別個(gè)體平均頭圍的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以下,伴有中度或輕度的智力障礙,未見(jiàn)其它神經(jīng)系統(tǒng)的異常.據(jù)統(tǒng)計(jì),

6、MCPH發(fā)病率為1/40,000~1/250,000,在一些近親婚配率高的國(guó)家MCPH的發(fā)病率也相對(duì)較高.MCPH存在遺傳學(xué)上的異質(zhì)性.迄今為止,已確定的MCPH致病基因位點(diǎn)達(dá)6個(gè),即MCPH1~MCPH6,分別位于染色體8p22-pter、19q13.3-q13.2、9q34、15q15-q21、1q31和13q12.2.六種類型的MCPH家系中,以致病基因定位于染色體1q31的MCPH5最為多見(jiàn).通過(guò)定位克隆技術(shù)已發(fā)現(xiàn)MCPH1和M

7、CPH5的致病基因microcephalin和ASPM(abnormal spindle-like microcephaly associated).MCPH致病基因的鑒定不僅有助于闡明其發(fā)生的遺傳機(jī)制,也有利于認(rèn)識(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和大腦的進(jìn)化過(guò)程.迄今為止,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于中國(guó)人MCPH家系中致病基因突變研究的文獻(xiàn)報(bào)道.我們收集到了一個(gè)兩代的MCPH家系,雙親(Ⅰ1和Ⅰ2)表型正常,非近親婚配,他們的兩個(gè)孩子(Ⅱ1和Ⅱ2)均為MCPH患者

8、.我們對(duì)這個(gè)家系進(jìn)行了ASPM致病基因的突變研究.首先從MCPH5位點(diǎn)所在的染色體1q31區(qū)域選擇5個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)多態(tài)標(biāo)記,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,對(duì)其等位片段進(jìn)行了分析,得到所有家系成員的等位基因型和單體型.結(jié)果顯示兩個(gè)患者具有相同的單體型,提示該家系的致病基因可能為定位于染色體1q31的ASPM.在基因型和單體型分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)ASPM基因進(jìn)行了突變分析.通過(guò)PCR擴(kuò)增出ASPM基因

9、部分外顯子及其相鄰內(nèi)含子序列,經(jīng)純化后進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測(cè)序.結(jié)果表明,兩患者ASPM基因存在一對(duì)復(fù)合型雜合無(wú)義突變,即:4672A>T(R1558X)和2791C>T(R931X).雙親分別為這兩個(gè)無(wú)義突變的雜合攜帶者.兩個(gè)無(wú)義突變都將導(dǎo)致ASPM基因翻譯提前終止,引起編碼蛋白截短,與正常ASPM蛋白(3477個(gè)氨基酸)相比分別丟失1920個(gè)氨基酸和2547個(gè)氨基酸.因此,我們新發(fā)現(xiàn)的ASPM基因無(wú)義突變將嚴(yán)重影響其編碼蛋白的正常功能