siRNA干擾A型流感病毒的初步研究.pdf

1、A型流感病毒(Influenza A virus)屬于正粘病毒科流感病毒屬，能夠引起鳥類、多種禽類、人類和哺乳動(dòng)物的流行性感染。據(jù)估計(jì)，全球每年流感患者死亡人數(shù)高達(dá)60萬(wàn)人。現(xiàn)行的疫苗通常由滅活病毒、減毒毒株或者重組表面糖蛋白組成，不但效果不好，而且因流感病毒表面抗原的不斷變化，疫苗需要不斷進(jìn)行調(diào)整。而抗流感病毒的藥物因其強(qiáng)烈的副作用和可能導(dǎo)致抗藥毒株的出現(xiàn)，其作用受到限制。因此尋找新的抗病毒方法對(duì)流感的治療意義重大。 RNA干

2、擾(RNAinterference，RNAi)是1998年首先在線蟲發(fā)現(xiàn)的由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。RNA干擾是一種基因沉沒(méi)的重要工具。能夠介導(dǎo)特定RNA降解的小干擾RNA(Small Interfering RNA，siRNA)已經(jīng)成為抑制病毒復(fù)制的又一選擇。 本研究以A型流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1)毒株進(jìn)化上較為保守的NP、M1和PB1基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)了15條小干擾RNA(sm

3、all interfering RNA，siRNA)，并將它們連接到表達(dá)載體pU6P上，構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體pU6P—siNP，pU6P—siM1，pU6P—siPB1。綜合應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等研究方法和技術(shù)手段進(jìn)行研究，確定了流感病毒RNA干擾實(shí)驗(yàn)的有效靶基因并且篩選出對(duì)流感病毒復(fù)制有良好抑制效果的siRNA。 通過(guò)雞胚尿囊腋HA血凝實(shí)驗(yàn)鑒定出針對(duì)PB1基因和NP基因的siRNA對(duì)A型流感病毒(H1N1)的繁殖有

4、抑制作用，部分有效的siRNA能使病毒HA滴度降低10倍以上；半定量PCR結(jié)果表明，siRNA的注入可以明顯降低病毒mRNA的豐度，說(shuō)明siRNA有效的促進(jìn)了病毒mRNA的降解；流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和Weston Blotting實(shí)驗(yàn)顯示siRNA可以明顯降低病毒蛋白的表達(dá)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給入siRNA可以使成雞避免死于A型流感病毒的感染。 本研究的結(jié)果表明，siRNA可以有效抑制流感病毒的復(fù)制，為流感病毒乃至其它之病病毒的防治提供了新