靶向肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的研究.pdf

1、肝癌是一種惡性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差。中國是各種肝癌的高發(fā)地，2012年全國每分鐘6人確診癌癥，其中肝癌發(fā)病率排名第二[1]。在全球，我國是肝癌發(fā)生的第一大國，其發(fā)病率占全球55％，死亡率占全球45％，中國目前每年約有32萬例肝癌患者死亡。我國肝癌患者不僅總數(shù)世界第一，發(fā)病率也是世界第一。中國是乙肝大國，我國的肝癌患者大多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，高危發(fā)病人群基數(shù)極大[2]。目前的肝癌治療手段無法從根本上改善肝癌的預(yù)后，亟待研究更

2、有效的治療方法用于肝癌的治療。
　　 腫瘤干細(xì)胞的存在已經(jīng)得到越來越多實驗數(shù)據(jù)的支持[3-7]，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一類具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和增生均與之密切相關(guān)，因此腫瘤干細(xì)胞是腫瘤治療的關(guān)鍵靶標(biāo)?；诖嗽O(shè)計能夠靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的實驗方案，從而對腫瘤組織起到根本性的清除作用[8]。
　　 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)，主要通過釋放穿孔素和顆粒酶來

3、殺傷靶細(xì)胞，并能通過Fas配體介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。其殺傷具有特異性、連續(xù)性、高效性，是機(jī)體免疫系統(tǒng)清除病毒和腫瘤細(xì)胞最主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞[9]。
　　 樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DCs)是體內(nèi)已知最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮巨大作用，DCs能夠直接將初始T細(xì)胞誘導(dǎo)成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)，誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生靶向殺傷作用。以

4、樹突細(xì)胞作為治療腫瘤的生物疫苗近年來成為腫瘤免疫治療的研究熱點之一[10]，相關(guān)的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)也顯示出DCs作為腫瘤疫苗有良好的治療前景，可以在一定程度上改善腫瘤患者預(yù)后，提高生存率[11-2]。
　　 本課題在常規(guī)采用腫瘤細(xì)胞總RNA誘導(dǎo)成熟DCs的基礎(chǔ)上，利用5型腺病毒Ad5作為載體將P53和TERT基因同時導(dǎo)入DCs細(xì)胞中，然后將成熟的DCs加入到初始T細(xì)胞中誘導(dǎo)其成為CTLs，在體外篩選和培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞并檢測CTLs對腫

5、瘤干細(xì)胞的殺傷。結(jié)果成功誘導(dǎo)出能夠高效靶向殺傷肝癌干細(xì)胞的CTLs，表明1）DCs能夠誘導(dǎo)出針對肝癌干細(xì)胞的CTLs;2）向DCs中導(dǎo)入攜帶P53和TERT基因的病毒后能夠進(jìn)一步提高CTLs對肝癌干細(xì)胞的殺傷活性。本實驗中所采用的腫瘤干細(xì)胞是肝癌Hep3B細(xì)胞系通過實驗室建立的肝癌干細(xì)胞新型培養(yǎng)體系誘導(dǎo)和篩選得來。實驗中用到的5型腺病毒載體Ad5是攜帶有ITR序列的病毒，反向末端重復(fù)序列(Inverted TerminalRepeat，

6、ITR)是腺病毒相關(guān)蛋白表達(dá)的順式作用元件，通過對照實驗表明攜帶有ITR序列的腺病毒在DCs中能夠增強(qiáng)蛋白表達(dá)的數(shù)量并延長表達(dá)時間，因此采用攜帶ITR序列的腺病毒提高P53和TERT基因在DCs中的表達(dá)，相關(guān)病毒載體來自于實驗室病毒載體庫。
　　 本實驗主要由以下五個部分組成:
　　 一、樹突細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)
　　 取正常人外周血，稀釋后加入含淋巴細(xì)胞分離液的分離管中，離心后在淋巴細(xì)胞分離液面之上得到含單核細(xì)

7、胞的白膜層細(xì)胞，小心吸取白膜層細(xì)胞，清洗2-3次后用AIM-V培養(yǎng)基稀釋，加入六孔板中，37℃、5％ CO2下靜置過夜，將未貼壁的細(xì)胞收集以便分離T淋巴細(xì)胞，向貼壁的細(xì)胞中加入粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)和FMS樣的酪氨酸激酶3(Flt3)配體，37℃、5％ CO2培養(yǎng)第5天加入肝癌干細(xì)胞總RNA，第6天加入病毒載體，第7天加入TNF-α刺激成熟，得到成熟的DCs，通過流式檢測DCs表型，結(jié)果表明D

8、Cs表達(dá)成熟DCs應(yīng)有的表型CD80, CD83, CD86, HLA-DR。
　　 二、攜帶P53和TERT的病毒載體的選擇
　　 采用表達(dá)綠色熒光的5型腺病毒載體對DCs進(jìn)行感染，比較攜帶ITR序列和未攜帶ITR序列的腺病毒載體感染DCs后綠色熒光蛋白在表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)時間上的差異，結(jié)果表明攜帶ITR序列的腺病毒載體在MOI=20時感染DCs后對蛋白基因的表達(dá)效果最好。
　　 三、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)<

9、br>　　 樹突細(xì)胞誘導(dǎo)和培養(yǎng)過程中未貼壁的白膜層細(xì)胞中主要含有B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，采用尼龍毛柱過濾吸附的方法，將此未貼壁的細(xì)胞加入預(yù)處理的尼龍毛柱中，由于尼龍毛對B淋巴細(xì)胞的親和力很大，當(dāng)混合細(xì)胞液通過尼龍毛柱時，B淋巴細(xì)胞被吸附，T淋巴細(xì)胞可以通過尼龍毛柱并得到收集，收集起來的T淋巴細(xì)胞可以用于CTLs的誘導(dǎo)。
　　 四、肝癌干細(xì)胞和特異性CTLs的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)
　　 采用實驗室建立的新型肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)基對肝

10、癌Hep3B細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)。將獲得的T淋巴細(xì)胞和誘導(dǎo)成熟的DCs在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞成為CTLs。通過流式檢測IFN-γ的分泌比例和Elispot實驗檢測IFN-γ的分泌強(qiáng)度，結(jié)果表明誘導(dǎo)出的CTLs的IFN-γ分泌比例高，強(qiáng)度大，具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性。
　　 五、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在體外對肝癌干細(xì)胞的殺傷實驗
　　 將兩種特異性CTLs:一種通過不攜帶病毒載體基因的DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生;另一種通過攜帶病毒

11、載體基因的DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生，分別和肝癌干細(xì)胞在體外進(jìn)行殺傷實驗，采用CCK-8試劑盒通過酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞殺傷，結(jié)果表明誘導(dǎo)出的CTLs對肝癌干細(xì)胞具有殺傷活性，且通過病毒攜帶P53和TERT基因感染DCs后再誘導(dǎo)出的CTLs，能夠進(jìn)一步提高CTLs對肝癌干細(xì)胞的殺傷。
　　 結(jié)論:本課題在體外成功建立了能高效殺傷腫瘤干細(xì)胞的CTLs，通過5型腺病毒載體攜帶P53和TERT基因感染DCs能進(jìn)一步提高DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs對肝癌干細(xì)胞