牦牛CAPN1和CAST基因克隆及其序列分析.pdf

1、鈣激活蛋白酶(Calpains)是一類特異性依鈣激活的中性半胱氨酸內(nèi)肽酶，其廣泛地分布于絕大多數(shù)動物細胞中。其中μ-calpain是在體內(nèi)由微摩爾鈣激活的無組織特異性的鈣蛋白酶，其大亞基蛋白編碼基因為CAPN1基因。鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)是高效的，專一的鈣激活蛋白酶活性抑制劑。研究表明，μ-calpain對于肌原纖維的降解和肉在冷凍貯藏過程中的嫩化具有重要作用，其大亞基的編碼基因CAPN1可作為影響肌肉嫩度的數(shù)量性狀位點(QTL)

2、的候選基因。其抑制劑CAST可抑制蛋白酶活性，降低蛋白質(zhì)水解，它的活性比值與嫩度高度相關(guān)。 本研究根據(jù)GenBank發(fā)表的普通牛CAPN1和CAST基因序列設(shè)計特異性引物，以天祝白牦牛cDNA為模板，分段進行RT-PCR擴增，克隆，測序。應(yīng)用生物軟件BioEdit對各測序結(jié)果進行序列拼接共獲得牦牛CAPN1 cDNA片段2267bp，其中包含一個2151bp的完整的開放閱讀框(ORF)，以及3’和5’末端非編碼區(qū)的部分序列(77

3、bp和166bp)。獲得牦牛CAST基因片段2445bp，其中包含一個2361bp的完整的開放閱讀框(ORF)(含一個起始密碼子ATG和終止密碼子TAA)。 分析表明：牦牛CAPN1基因編碼區(qū)全長2151bp，共編碼716個氨基酸。與已報道的牛、豬、人、小鼠的序列進行比較，核苷酸同源性分別為99.3％，93.9％，90.0％，85.5％。預(yù)測氨基酸的同源性分別為99.4％，96.1％，94.6％，89.0％，并且對牦牛CAPN1

4、四個結(jié)構(gòu)域分別進行NCBI BLAST發(fā)現(xiàn)四個結(jié)構(gòu)域在以上四個物種中都顯示出很好的保守性，最為保守的在結(jié)構(gòu)域Ⅳ(>96％)。牦牛與牛產(chǎn)生的14個核苷酸突變位點中，有3個產(chǎn)生了氨基酸突變，均發(fā)生在結(jié)構(gòu)域Ⅲ。牦牛CAST基因的編碼區(qū)全長2361bp，編碼786個氨基酸。同源性分析表明其核酸和蛋白質(zhì)序列在不同哺乳動物之間也有很高的同源性，一些親水性的氨基酸在不同物種間具有高度的保守性。分別對兩個基因構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹表明：聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)