嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染褪黑素合成酶基因的研究.pdf

1、褪黑素(Melatonin，MT)是吲哚神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)生物鐘、直接清除體內(nèi)自由基、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能等功效。通過乳腺反應(yīng)器來生產(chǎn)褪黑素具有研究意義和商業(yè)前景。嶗山奶山羊是我國特有的山羊品種，具有優(yōu)良的產(chǎn)奶性能，是乳腺反應(yīng)器的良好模型。本研究針對褪黑素關(guān)鍵合成酶AANAT和HIOMT基因乳腺特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞的操作進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。
　　本研究通過活體采集嶗山奶山羊的乳腺組織，利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)奶山

2、羊乳腺上皮細(xì)胞，純化后分別轉(zhuǎn)染AANAT和HIOMT基因，檢測這兩個(gè)外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平和合成褪黑素的水平，以驗(yàn)證是否可以作為轉(zhuǎn)基因的供體細(xì)胞。
　　(1)采取綿羊松果體細(xì)胞中克隆出AANAT和HIOMT基因，使用XhoⅠ酶切并連接，構(gòu)建載體pBC1-AANAT和pBC1-HIOMT。再由質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-his中擴(kuò)增純化得到上下游均添加了NotⅠ酶切位點(diǎn)的Neo片段，通過對Neo擴(kuò)增片段及質(zhì)粒pBC1-AANA

3、T/pBC1-HIOMT進(jìn)行NotⅠ單酶切后，連接片段構(gòu)建能夠在真核細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選的重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo。菌液PCR和酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明呈陽性，檢測序列正確。
　　(2)采集泌乳期健康嶗山奶山羊乳腺組織，進(jìn)行組織塊貼壁培養(yǎng)法分離得到兩組山羊乳腺上皮細(xì)胞，利用相差消化法進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的分離純化。結(jié)果顯示得到純凈的乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞呈鵝卵石樣，排列緊密，高倍顯微鏡下觀察可見多核，呈典型

4、上皮細(xì)胞特征。細(xì)胞生長曲線類似與“S”形，符合細(xì)胞生長的生物學(xué)規(guī)律。
　　(3)使用脂質(zhì)體2000將真核表達(dá)載體pBC1-AANAT-Neo，pBC1-HIOMT-Neo分別轉(zhuǎn)染到嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，建立了乳腺上皮細(xì)胞的兩種合成酶過表達(dá)系統(tǒng)。通過檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中AANAT和HIOMT的mRNA相對表達(dá)水平，驗(yàn)證表達(dá)載體是否轉(zhuǎn)染成功。使用添加褪黑素合成前體五羥色胺(5-HT)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞24 h后，檢測培養(yǎng)液中褪

5、黑素含量。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染AANAT和HIOMT的乳腺上皮細(xì)胞中都高表達(dá)了相應(yīng)的基因，其合成酶AANAT和HIOMT的mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組(p＜0.01);轉(zhuǎn)染AANAT的乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入五羥色胺（5-HT），培養(yǎng)液中MT濃度顯著高于對照組(p＜0.01)。表明此轉(zhuǎn)染體系能夠成功獲得轉(zhuǎn)AANAT及HIOMT的嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，并在存在褪黑素合成前體5-HT的情況下，合成顯著高于對照組的褪黑素量(45.31±