脂多糖對活化的肝星狀細胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　 肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀的一個病理過程。許多肝臟慢性炎癥疾病如慢性乙型和丙型病毒性肝炎、慢性酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和原發(fā)性硬化性膽管炎等均可引起肝纖維化。肝纖維化作為肝臟對損傷的一種修復反應，其中心環(huán)節(jié)是肝臟炎癥反應激活肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)，活化的HSC增殖加快，分泌大量膠原在細胞外基質(extracellu

2、larmatrix，ECM)過多沉積。目前，研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化為一動態(tài)發(fā)展的可逆性病變，活化的HSC的凋亡是肝纖維化發(fā)生逆轉的重要原因。
　　 活化的HSC凋亡主要受到神經生長因子(nervegrowthfactor，NGF)的調節(jié)：肝實質細胞的慢性損傷時，一方面釋放并激活各種炎性介質和細胞因子，形成“炎性瀑布”，通過旁分泌途徑促進HSC的活化、增殖，TLR4/NF-κB軸在炎癥促肝纖維化發(fā)生中起著核心作用；另一方面，肝細胞會釋放

3、NGF，與活化HSC細胞上的受體p75NTR結合，誘導活化HSC凋亡，抑制膠原纖維的“過度”沉積，調節(jié)肝纖維化的進展。慢性肝病-肝纖維化發(fā)生過程中，循環(huán)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)增多，主要與其受體TLR2/TLR4結合，通過TLR4/NF-κB軸促進肝纖維化的發(fā)生。肝纖維化的發(fā)生是活化HSC增殖/凋亡失衡的結果。那么，LPS-TLR2/TLR4-NF-κB是否對活化HSC凋亡有何影響呢?這值得我們進一步研究。

4、已有研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR的表達受到TLR相關的MyD88依賴性信號通路的調節(jié)。因此，我們推測肝纖維化發(fā)生時，高表達LPS一方面抑制肝細胞NGF的分泌，另一方面通過TLR-MyD88-NF-κB軸抑制p75NTR表達及凋亡相關通路，抑制活化HSC的凋亡，促進肝纖維化的發(fā)生與進展。
　　 本研究擬通過建立大鼠肝纖維化模型，觀察血漿脂多糖濃度；分析其與肝纖維化的關系；分離大鼠HSC，體外LPS激活HSC的TLR4表達，siRNA干擾

5、MyD88信號分子，阻斷NF-κB，觀察HSC對NGF誘導凋亡的反應，探討TLR4調控的先天免疫反應對NGF誘導的HSC凋亡過程的影響：同時分離大鼠肝細胞，研究LPS對肝細胞NGF分泌的影響，從而說明TLR激活的相關途徑在HSC凋亡中的作用，這將為炎癥對肝纖維化進展及纖維化的逆轉的調控機制提供新的思路與方法。
　　 研究方法:
　　 采用兩種致大鼠肝纖維化模型，分別為二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，

6、DMN)腹腔注射4周所致化學損傷型肝纖維化模型(10μg/kg，每周連續(xù)3天)及膽管結扎(bileductligation，BDL)所致膽汁淤積性肝纖維化模型(約4周)，檢測各組血清中丙氨酸氨基轉移酶(alaninetransarninase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartateaminotransferase，AST)、總膽紅素(totalbilirubin，TB)、直接膽紅素(conjugatedbilirubin，DB

7、)、凝血酶時間(prothrombintime，PT)和γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，γ-GGT)；伊紅(hematoxylinandeosin，HE)染色、Masson染色及苦味酸酸性復紅(vangieson，VG)染色評估各組肝纖維化病理進程，研究兩種不同機制所致肝纖維化大鼠的血漿脂多糖的濃度的變化；采用原位酶消化-密度梯度離心分離大鼠肝星狀細胞，體外脂多糖(LPS)(10μg/ml)不同時間(

8、30min、1h、6h、12h)作用HSC，神經生長因子(NGF)不同濃度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)作用HSC24小時，確定LPS最佳作用時間和NGF最佳作用濃度；用CCK-8檢測細胞增殖，LPS作用HSC1小時后，NGF繼續(xù)作用HSC24小時，用流式細胞術、TUNEL法檢測細胞凋亡，Realtime-PCR與Western-blot分別檢測細胞凋亡相關基因及蛋白的表達；并用MyD88SiRNA和抑制劑BAY

9、分別干擾MyD88途徑及阻斷NF-κB信號通路，檢測細胞凋亡相關基因及凋亡相關蛋白的表達和神經生長因子及其受體表達。同時分離大鼠肝細胞，研究LPS對肝細胞NGF分泌的影響及肝細胞對活化HSC凋亡的影響。
　　 結果:
　　 一、肝纖維化與血漿LPS的關系
　　 1、與正常大鼠比較，BDL組模型大鼠血清PT、AST、TB、DB及γ-GGT明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)；ALB明顯降低(P＜0.05)；ALT

10、水平無明顯變化。與正常大鼠比較，DMN組大鼠(4w)，血清PT、AST、TB、DB及γ-GGT均明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)；ALB明顯降低(P＜0.05)；ALT水平無明顯變化。
　　 2、與正常大鼠比較，BDL模型大鼠血漿LPS濃度明顯增高(P＜0.01)；不同時間DMN模型組大鼠(2w、3w、4w)LPS濃度明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)，并且第4周的LPS濃度最高(P＜0.01)。
　　 二、脂

11、多糖對活化肝星狀細胞凋亡的影響
　　 1.成功分離、鑒定、培養(yǎng)HSC，LPS(10μg/ml)作用活化HSC不同時間(30min、1h、6h、12h)，LPS作用1h能明顯促進TLR4、MyD88mRNA及TRAFmRNA水平的表達(P＜0.01)；不同濃度的NGF(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)作用HSC24小時，發(fā)現(xiàn)NGF(200ng/ml)作用24h明顯促進HSC凋亡，明顯促進fas、bax、p53及

12、p75NTR的mRNA水平的表達(P＜0.05)，明顯抑制bcl-2mRNA水平的表達(P＜0.05)。
　　 2.NGF(200ng/ml，24h)能明顯抑制HSC增殖(P＜0.01)，LPS(10μg/ml，1h)能明顯促進HSC細胞增殖(P＜0.05)。
　　 3.流式細胞儀和FITC-TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)LPS(10μg/ml，1h)能明顯抑制由NGF(200ng/ml，24h)誘導的HSC的凋亡(P＜0.05)；

13、
　　 4.RealtimePCR顯示LPS(10μg/ml，1h)能明顯抑制由NGF(200ng/ml，24h)誘導的bax、p53/p75NTR、NGF的mRNA水平的表達(P＜0.05)，明顯促進NGF抑制的bcl-2mRNA的表達(P＜0.05)。
　　 5.Westernblot顯示LPS(10μg/ml，1h)能明顯抑制由NGF(200ng/ml，24h)誘導的bax、p75NTR、NGF、cleaved-c

14、aspase3、cleaved-caspase9和PARP蛋白水平的表達(P＜0.05)，能明顯促進NGF抑制的bcl-2蛋白水平的表達(P＜0.05)；
　　 三、MyD88依賴的NF-κB途徑在LPS抑制活化HSC凋亡中的作用
　　 1、抗TLR2、TLR4抗體作用HSC后，發(fā)現(xiàn)TLR4而不是TLR2抗體能明顯拮抗LPS對NGF誘導的HSC的凋亡相關蛋白cleavedcaspase3、cleavedcaspase9、

15、PARP及Bax的表達的抑制和p75NTR表達的抑制(P＜0.05)。
　　 2、LPS、MyD88siRNA對HSC凋亡沒有明顯影響；MyD88siRNA減少LPS對NGF誘導HSC凋亡的抑制(P＜0.05)；MyD88siRNA能減少LPS對NGF誘導的HSC凋亡相關蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、PARP及Bax的表達的抑制和p75NTR表達的抑制(P＜0.05)；且MyD88siR

16、NA能明顯抑制LPS作用HSC后p-IκB、p50和胞核p65蛋白水平的增加(P＜0.05)。
　　 3、用NF-κB通路抑制劑BAY作用HSC，LPS對NGF誘導的HSC凋亡現(xiàn)象的抑制作用和凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase9、PARP、bax表達的抑制作用及p75NTR表達的抑制作用明顯減弱(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 四、LPS對肝細胞/星狀細胞共培養(yǎng)中HSC凋

17、亡的影響
　　 1、成功分離肝細胞，LPS作用肝細胞后，肝細胞NGFmRNA的表達和NGF蛋白的表達均較正常明顯減少(P＜0.05)；
　　 2、活化的HSC能誘導肝細胞分泌NGF，且肝細胞與活化HSC共培養(yǎng)能誘導HSC的凋亡(P＜0.05)。LPS作用后的肝細胞和活化HSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)活化HSC凋亡明顯減少(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1、肝纖維化形成過程中，血漿LPS濃度與肝纖維化發(fā)展成正相