維甲酸信號通路誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及骨肉瘤腫瘤發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、背景:人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)在體內(nèi)多種因素的調(diào)節(jié)下可以發(fā)育為成骨細(xì)胞,對正常的骨發(fā)育和維持骨代謝平衡十分重要。而另一方面,骨的發(fā)育過程異常與骨肉瘤的發(fā)生有密切關(guān)系,如果hMSCs在成骨分化的任意階段發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,那么就可能產(chǎn)生腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSCs)而導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生。本論文就骨的正常發(fā)育機(jī)制和骨肉瘤發(fā)生的原因進(jìn)行研究,試圖尋找可以促進(jìn)骨正常發(fā)育的新化合物,同時從CSC的視角分析骨肉瘤發(fā)生的機(jī)制

2、,最后綜合分析正常骨發(fā)育和腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中基因譜的差異,為進(jìn)一步認(rèn)識骨分化的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論數(shù)據(jù),為揭示骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制及其治療策略提供全新的思路。本研究將主要分為三個部分:(1)研究維甲酸及其信號通路對hMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制,從分子水平了解正常骨發(fā)育的變化規(guī)律。(2)尋找骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞的表面標(biāo)記物,并利用這些表面標(biāo)記物分離和鑒定骨肉瘤的腫瘤起始細(xì)胞,探討骨肉瘤發(fā)生的可能機(jī)制。(3)結(jié)合正常骨分化模型和

3、骨肉瘤發(fā)生模型,利用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)手段比較病理過程和正常分化過程中細(xì)胞的全基因譜的差異,尋找骨肉瘤發(fā)生早期的關(guān)鍵基因以及可以用于診斷和治療骨肉瘤的潛在生物標(biāo)記物,為臨床上骨肉瘤的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　第一部分RARa信號通路調(diào)控人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用及其機(jī)制
　　研究目的:全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的衍生物,機(jī)體內(nèi)一定濃度的維甲酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和成熟,是機(jī)體正常生長發(fā)育和各

4、種生理活動必不可少的重要因子,同時維甲酸也是一種作用很強(qiáng)的分化誘導(dǎo)劑,在惡性腫瘤的發(fā)生與治療方面也有著重要的作用。本課題主要研究ATRA對hMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)作用及其可能的分子機(jī)制,以及低磷酸化狀態(tài)RARa對hMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)作用。 方法和結(jié)果：ATRA在hMSCs的成骨分化的早期過程中加入可以有效地促進(jìn)堿性磷酸酶的活性,抑制hMSCs的細(xì)胞增殖,明顯上調(diào)骨分化的主要轉(zhuǎn)錄因子Runx2的mRNA和蛋白水平,同時骨分化的標(biāo)

5、志蛋白OPN和Osteocalcin的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)。利用基因芯片技術(shù)比較經(jīng)ATRA誘導(dǎo)分化的hMSCs中全基因表達(dá)譜的變化,發(fā)現(xiàn)大量骨分化相關(guān)基因的表達(dá)均出現(xiàn)2倍以上的增加。隨后我們在正常培養(yǎng)的hMSCs上檢測到了內(nèi)源性ATRA的分泌。利用慢病毒載體在hMSCs上高表達(dá)低磷酸化的RARa,培養(yǎng)7天后hMSCs會自發(fā)地出現(xiàn)堿性磷酸酶活性增加以及鈣沉積增多,細(xì)胞增殖也明顯受到抑制,同時骨分化的標(biāo)志蛋白OPN和Osteocalcin的表達(dá)也

6、被上調(diào)。另一方面,ATRA和經(jīng)典的BDM誘導(dǎo)hMSCs成骨分化過程中,BMP8a的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào),而且高表達(dá)RARaS77A的hMSCs出BMP8a的表達(dá)也出現(xiàn)明顯上調(diào)。在hMSCs過表達(dá)BMP8a以后,細(xì)胞自發(fā)地會出現(xiàn)鈣沉積的增多和骨分化的標(biāo)志蛋白OPN的上調(diào)。此外,Fgf8f在高表達(dá)RARaS77A的hMSCs中蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯上調(diào),而在hMSCs過表達(dá)Fgf8f以后,hMSCs也自發(fā)地會出現(xiàn)鈣沉積的增多。
　　結(jié)論:本

7、研究證明ATRA和地塞米松聯(lián)合在hMSCs成骨分化的早期應(yīng)用可以明顯地促進(jìn)hMSCs的成骨分化,其中ATRA可能是通過降低RARa的磷酸化水平來激活下游BMP8a和Fgf8f信號通路,進(jìn)而啟動Runx2對下游骨分化靶基因ALP、OPN、Osteocalcin等的轉(zhuǎn)錄,最終促進(jìn)了hMSCs的成骨分化過程。
　　第二部分人骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞以及骨肉瘤腫瘤形成細(xì)胞的鑒定
　　目的:骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤,目前也被認(rèn)為

8、是一種細(xì)胞分化異常的疾病。腫瘤干細(xì)胞理論可以很好的解釋骨肉瘤對放化療的抵抗、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移,因此闡明骨肉瘤的細(xì)胞起源,鑒定并分離出骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞對于骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防以及研究針對腫瘤干細(xì)胞的新型藥物都有很重要的意義。本論文試圖尋找骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞的表面標(biāo)記物,并利用這些表面標(biāo)記物分離骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞,揭示骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞的生物學(xué)本質(zhì),從而將骨肉瘤腫瘤起始細(xì)胞(Osteosarcoma-initiating cells, OS

9、ICs)和骨肉瘤腫瘤形成細(xì)胞(Osteosarcoma-forming cells, OSFCs)加以區(qū)分。
　　方法和結(jié)果:(1)利用連續(xù)接種裸小鼠的方法可以提高OSICs的自我更新能力進(jìn)而產(chǎn)生更多的子代細(xì)胞促進(jìn)腫瘤組織的形成,本研究發(fā)現(xiàn)CD49f+細(xì)胞可以維持骨肉瘤腫瘤的生長。通過對CD49f+細(xì)胞及其親代細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)外譜系追蹤實(shí)驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)CD49f+細(xì)胞是由CD49f-細(xì)胞產(chǎn)生的。進(jìn)一步比較CD49f+和CD49f

10、-細(xì)胞的生物學(xué)特性,研究發(fā)現(xiàn)CD49f+細(xì)胞在成瘤能力和化療藥物耐受方面均不如親代CD49f-細(xì)胞,更為重要的是, CD49f-細(xì)胞還可以產(chǎn)生CD133+細(xì)胞。在30.5％的CD49f UT2細(xì)胞中僅含有0.97%的CD49fCD133+細(xì)胞,而這少數(shù)的CD49fCD133+細(xì)胞亞群卻比CD49f-細(xì)胞可以產(chǎn)生更多的CD49f+細(xì)胞亞群。在可以生成腫瘤的CD49fCD133+、CD49f、CD49f+、CD133+和CD133-所有亞群

11、中,只有CD49fCD133+細(xì)胞表現(xiàn)出最高的成瘤率(75%), CD49f、CD49f+、CD133+和CD133-分別為55.6%、44.4%、33.3%和25%。(2)裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,盡管CD49f、CD49f、CD133+和CD133-細(xì)胞亞群均表現(xiàn)出一定的體內(nèi)成瘤能力,但是OSICs中的CD49fCD133+細(xì)胞亞群比上述4個亞群具有更強(qiáng)的成瘤能力。此外,在連續(xù)的移植瘤模型中子代CD49f+細(xì)胞盡管成瘤能力不強(qiáng),但是

12、卻具有更強(qiáng)的成骨分化能力。相應(yīng)地,CD49fCD133+細(xì)胞具有和CD49f-、CD49f、CD133+、CD133-、CD49fCD133細(xì)胞類似的脂肪細(xì)胞分化能力和較高的成瘤率,但是CD49fCD133+細(xì)胞的成骨分化能力卻相對下降了。在UT2細(xì)胞和U20S細(xì)胞上也觀察到了同樣的現(xiàn)象,即具有較強(qiáng)成瘤能力的UT2細(xì)胞的成骨分化相關(guān)基因發(fā)生了下調(diào),而脂肪分化相關(guān)基因沒有進(jìn)一步下調(diào)。這些數(shù)據(jù)說明CD49fCD133+田胞以及經(jīng)連續(xù)移植瘤實(shí)

13、驗(yàn)提高了自我更新和成瘤能力的UT2細(xì)胞均伴隨著成骨分化能力減弱的現(xiàn)象。(3)為了明確CD117+和Stro-1+是否和CD49fCDl33+細(xì)胞亞群具有類似的自我更新和成瘤能力,本研究在具有較高成瘤率的UT2細(xì)胞上分析這些標(biāo)記物的成瘤能力,將500個CD117+、CD117-、Stro-1+、Stro-l-、CD49f、CD49f+、CDl33+和CD133-UT2細(xì)胞分別注射到NOD/SClD小鼠背部,研究顯示和CD49f-、CD49

14、F+、CD133+以及CD133-UT2細(xì)胞相比,CD117+、CD117-、Stro1+、Stro-l-UT2細(xì)胞的成瘤率很低或者沒有。(4)目前,關(guān)于CD49f和CD133+對于OSICs細(xì)胞的維持和在干細(xì)胞標(biāo)記物中的作用仍然不是很清楚,基因芯片數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)nt、Notch、BMI1和TGF-β信號通路在經(jīng)移植瘤模型激活的UT2細(xì)胞中明顯上調(diào),這就提示這些通路在UT2細(xì)胞中的CD49fCD133+細(xì)胞亞群的自我更新和成瘤能力中十分重要

15、。
　　結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)了OSICs中富集著CD49fCD133+細(xì)胞,而且OSICs產(chǎn)生的CD49fCD133+細(xì)胞存在著成瘤能力和成骨分化能力互斥的關(guān)系,這些研究不僅為進(jìn)一步尋找和CD49fCD133+聯(lián)合的其他腫瘤干細(xì)胞潛在標(biāo)記物以及研究不同信號通路在OSICs和OSFCs中的作用奠定了前期基礎(chǔ),也證明在區(qū)分CSCs.子代祖細(xì)胞和腫瘤形成細(xì)胞中聯(lián)合應(yīng)用譜系追蹤、成瘤能力對比、藥敏實(shí)驗(yàn)等多種手段是非常必要的。
　　第

16、三部分調(diào)控成骨分化和骨肉瘤發(fā)生的差異基因表達(dá)譜研究
　　目的:隨著我們對干細(xì)胞認(rèn)識的加深,越來越多的證據(jù)提示骨肉瘤應(yīng)該是由于hMSCs在成骨分化過程中發(fā)生基因以及表型的改變終止了正常分化進(jìn)程而形成的分化疾病。因此本部分的研究將第一部分ATRA促進(jìn)hMSCs的正常成骨分化模型和前期的ATRA誘導(dǎo)骨肉瘤U20S細(xì)胞的分化治療模型,以及第二部分骨肉瘤細(xì)胞模型,利用人類基因組表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)手段對調(diào)控成骨分化和骨肉瘤生成的基因進(jìn)行了

17、嚴(yán)格比較和篩選,全面分析和比較病理過程和分化過程中全基因譜的差異,試圖從中尋找骨肉瘤發(fā)生最早期及最關(guān)鍵的因子,并借此尋找潛在的診斷和治療骨肉瘤的生物標(biāo)記物,為將來治療骨肉瘤提供一些新的靶點(diǎn)和思路。
　　方法和結(jié)果:(1)通過分析4株具有不同遺傳背景的骨肉瘤細(xì)胞的全基因譜表達(dá),發(fā)現(xiàn)了438個基因的表達(dá)在4株細(xì)胞上呈現(xiàn)共同的變化趨勢,其中共同表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因有133個,而共同表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有305個,通過IPA軟件分析這

18、些基因和骨肉瘤生成密切相關(guān);(2)通過分析hMSCs的骨分化模型、骨肉瘤U20S細(xì)胞的分化治療模型和4株具有不同遺傳背景的骨肉瘤細(xì)胞的全基因譜表達(dá)情況,研究發(fā)現(xiàn)了295個在骨分化和骨肉瘤生成中分別具有相反的表達(dá)趨勢的基因,通過DAVID軟件對其生物學(xué)功能進(jìn)行歸類分析發(fā)現(xiàn)這295個差異基因主要為細(xì)胞接觸、跨膜蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、泛素樣蛋白、膠原、代謝酶、受體、分泌的細(xì)胞外信號、骨系統(tǒng)發(fā)育蛋白、蛋白酶等;(3)我們在295個差異基因中發(fā)現(xiàn)

19、了13個轉(zhuǎn)錄因子,分別為EPAS1、FOS、GTF2A1L、MXD1、CDKN2A、CDKN2B、CHURC1、GLIS3、NFKBIZ、HOXB6、FOXF1、BCL11A和EGR2。其中EPAS1、FOS和GTF2A1L這3個基因表達(dá)水平在骨形成過程中上調(diào),但是在骨肉瘤發(fā)生過程中卻明顯下調(diào),而MXD1、CDKN2A、CDKN2B. CHURc1 GLIS3和NFKBIZ這6個基因在骨肉瘤發(fā)生過程中明顯下調(diào),但是在骨形成過程中變化不明

20、顯,只有HOXB6、FOXF1、BCL11A和EGR2這4個轉(zhuǎn)錄因子在骨肉瘤發(fā)生過程中發(fā)生了明顯的上調(diào),但是在骨形成過程中變化不明顯的。(4)我們在上述的295個基因中發(fā)現(xiàn)了包括ADAMTS2、ADRB2、B4GALT1、BTN3A1、CD14、CDKN2A、CDKN2B、CH13L1、COLLA1、CYPLB1、DPP4、DPYSL3、ENG、EPAS1、FN1、FOS、HOXB6、IGFBP3、ITGA5、MCM7、OPTN、RAR

21、RES1 SNAP25和SPARC在內(nèi)的24個潛在的生物標(biāo)記物的變化在骨肉瘤發(fā)生過程和骨形成過程出現(xiàn)明顯差異,其中ADRB2、HOXB6和MCM7這3個潛在的骨肉瘤標(biāo)記物,對于尋找骨肉瘤發(fā)生最早期及最關(guān)鍵的步驟,以及尋找潛在的診斷和治療骨肉瘤的生物標(biāo)記物具有重要的指導(dǎo)意義。
　　結(jié)論:本部分研究報(bào)道了295個在骨分化和骨肉瘤生成中分別具有相反的表達(dá)趨勢的基因,而且發(fā)現(xiàn)了HOXB6、FOXF1、BCL11A和EGR2這4個轉(zhuǎn)錄因子與