長(zhǎng)牡蠣DNA甲基化研究.pdf

1、表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不發(fā)生改變的情況下基因表達(dá)發(fā)生的可遺傳的改變，DNA甲基化是目前研究最為成熟的一種表觀遺傳修飾，與基因組防御、基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。目前DNA甲基化的研究主要集中在哺乳動(dòng)物及植物中，水產(chǎn)動(dòng)物的研究相對(duì)匱乏。長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）又名太平洋牡蠣，是我國(guó)乃至世界上產(chǎn)量最大的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，因其生活于環(huán)境多變的潮間帶并且具有復(fù)雜的生物學(xué)特征而成為水產(chǎn)動(dòng)物研究的模式生物，對(duì)長(zhǎng)牡蠣的DNA甲基化進(jìn)行研

2、究有助于了解水產(chǎn)動(dòng)物DNA甲基化的分子機(jī)制和功能，解析水產(chǎn)動(dòng)物復(fù)雜生物學(xué)特征及對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)理。本研究針對(duì)長(zhǎng)牡蠣開(kāi)展了DNA甲基化的基礎(chǔ)研究，分析了DNA甲基化的遺傳模式、組織特異性及三倍體和選育群體中DNA甲基化的變異，以期為后期相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　1、長(zhǎng)牡蠣DNA甲基化的遺傳模式
　　采用熒光標(biāo)記的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(F-MSAP)方法，研究長(zhǎng)牡蠣親本甲基化和非甲基化位點(diǎn)在子代的分離，檢測(cè)DNA甲基化在親

3、子代間的遺傳模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)牡蠣90.6％的親本甲基化位點(diǎn)遵循孟德?tīng)柖煞€(wěn)定遺傳給子代，甲基化位點(diǎn)較非甲基化位點(diǎn)更加偏離孟德?tīng)柗蛛x比，與親本相比，子代存在22個(gè)去甲基化位點(diǎn)，7個(gè)超甲基化位點(diǎn)和30個(gè)從頭甲基化位點(diǎn)。
　　2、DNA甲基化在長(zhǎng)牡蠣不同組織中的分化
　　采用F-MSAP方法對(duì)10只野生長(zhǎng)牡蠣6個(gè)組織（鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、性腺、消化盲囊）的基因組甲基化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)牡蠣不同組織間DNA甲基化水平存在

4、差異，消化盲囊、唇瓣、閉殼肌組織的甲基化水平較高，其中消化盲囊與鰓和外套膜組織的甲基化水平差異顯著，其他組織間差異并不顯著。長(zhǎng)牡蠣中存在組織特異性和非組織特異性甲基化位點(diǎn)，然而由于牡蠣雜合度高，個(gè)體之間差異較大，未發(fā)現(xiàn)10個(gè)個(gè)體一致存在的組織特異性/非組織特異性甲基化位點(diǎn)。
　　3、長(zhǎng)牡蠣三倍體基因組DNA甲基化研究
　　采用細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)產(chǎn)生長(zhǎng)牡蠣二倍體和三倍體家系，采用F-MSAP方法對(duì)二倍體和三倍體的閉殼肌和性腺組織

5、的DNA甲基化進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二倍體與三倍體長(zhǎng)牡蠣整體DNA甲基化水平在閉殼肌和性腺組織中都不存在差異，僅存在少量倍性特異性位點(diǎn)。通過(guò)與親本基因型比較發(fā)現(xiàn)，三倍體的甲基化位點(diǎn)和未甲基化位點(diǎn)的變異率都高于二倍體?；谥鞒煞址治龇椒▽?duì)二倍體和三倍體的閉殼肌及性腺組織的表觀遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，長(zhǎng)牡蠣不同倍性及不同組織之間的表觀遺傳結(jié)構(gòu)存在較大差異，這暗示了二倍體與三倍體可能在某些甲基化位點(diǎn)存在差異，而不引起整體甲基化水平的變化。二倍體和三倍

6、體長(zhǎng)牡蠣中，都存在雄性特異性甲基化位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)雌性中特有的甲基化位點(diǎn)。
　　4、長(zhǎng)牡蠣三倍體生殖相關(guān)基因表達(dá)與甲基化模式分析
　　采用定量PCR對(duì)8個(gè)生殖相關(guān)基因在增值期和成熟期的二倍體和三倍體性腺組織的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有增殖期的putative Vg基因和成熟期的caER基因在二倍體與三倍體中表達(dá)差異顯著。采用亞硫酸鹽處理測(cè)序方法對(duì)這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子及編碼區(qū)的CpG島甲基化情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Putative

7、 Vg基因啟動(dòng)子及編碼區(qū)含有6個(gè)CpG島，但所有CpG島不存在胞嘧啶甲基化修飾，caER基因啟動(dòng)子區(qū)域無(wú)CpG島，編碼區(qū)含有5個(gè)CpG島，位于第六外顯子和第十外顯子的CpG島存在甲基化修飾，其中第六外顯子CpG島胞嘧啶甲基化在二倍體和三倍體中不存在差異，而第十外顯子CpG島胞嘧啶甲基化在二倍體和三倍體中存在差異，可能與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)。
　　5、長(zhǎng)牡蠣人工選育群體DNA甲基化研究
　　采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法和

8、甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)方法對(duì)長(zhǎng)牡蠣快生長(zhǎng)品系“海大一號(hào)”基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳及表觀遺傳變異進(jìn)行分析。結(jié)果顯示基礎(chǔ)群體與選育群體總體DNA甲基化水平并無(wú)差異，然而對(duì)每個(gè)甲基化位點(diǎn)在兩個(gè)群體中出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，82個(gè)甲基化位點(diǎn)中有9個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)群體中出現(xiàn)的頻率存在顯著差異。協(xié)慣量方差分析顯示表觀遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，但是部分個(gè)體具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)卻表現(xiàn)出差異較大的表觀遺傳結(jié)構(gòu)，選育群體的遺傳多樣性與表觀遺傳多樣性都略